Dans le présent protocole, la technique d’électrophorèse des glucides assistée par fluorophore (FACE) est utilisée pour déterminer la distribution de la longueur de la chaîne (CLD) et la longueur moyenne de la chaîne (ACL) du glycogène.
Les particules de glycogène sont des polysaccharides ramifiés composés de chaînes linéaires d’unités glucosyliques liées par des liaisons glucosides α-1,4. Ces derniers sont attachés les uns aux autres par α-1,6 liaisons glucosides, appelées points de branchement. Parmi les différentes formes de stockage du carbone (c’est-à-dire l’amidon, le β-glucane), le glycogène est probablement l’un des polysaccharides de stockage les plus anciens et les plus réussis que l’on trouve dans le monde vivant. Les chaînes de glucane sont organisées de manière à ce qu’une grande quantité de glucose puisse être rapidement stockée ou alimentée dans une cellule en cas de besoin. De nombreuses techniques complémentaires ont été développées au cours des dernières décennies pour résoudre la structure fine des particules de glycogène. Cet article décrit l’électrophorèse glucidique assistée par fluorophore (FACE). Cette méthode quantifie la population de chaînes de glucanes qui composent une particule de glycogène. Également connu sous le nom de distribution de longueur de chaîne (CLD), ce paramètre reflète la taille des particules et le pourcentage de ramification. C’est également une exigence essentielle pour la modélisation mathématique de la biosynthèse du glycogène.
Le glycogène, utilisé comme stockage de carbone et d’énergie, est un homopolymère du glucose constitué de chaînes linéaires d’unités glucosyliques liées par des liaisons (1 → 4)-α et attachées par (1 → 6)-α des liaisons glycosidiques ou des points de ramification. Ils apparaissent sous forme de particules β et α dans le cytosol d’un large éventail d’organismes. β-particules sont de minuscules particules solubles dans l’eau principalement observées chez les procaryotes. Leur diamètre varie de 20 à 40 nm, probablement dicté par les enzymes métabolisant le glycogène et l’obstacle stérique 1,2.
D’abord décrites dans des cellules animales, les plus grandes particules de α présentent jusqu’à 300 nm de diamètre avec une forme de chou-fleur. Cette organisation particulière peut provenir de l’agrégation de plusieurs particules de β ou peut survenir en bourgeonnant à partir d’une seule particule β3. Fait intéressant, une étude récente a rapporté la présence de particules de α dans Escherichia coli4. Cependant, contrairement aux particules α provenant de cellules animales, ces dernières s’effondrent rapidement au cours du processus d’extraction, ce qui peut expliquer le manque de données dans la littérature4. L’apparition de particules de α chez les eucaryotes et les procaryotes implique des enzymes métabolisant le glycogène phylogénétiquement non apparentées5. Cela soulève des questions concernant la fonction de ces particules et la nature des agents de réticulation potentiels entre β-particules5.
Bien que deux modèles mathématiques opposés aient été proposés pour la formation de molécules de glycogène 6,7,8,9, il est généralement admis que les particules de β ont évolué en réponse à leur fonction métabolique en tant que réserve de carburant très efficace pour la libération rapide de grandes quantités de glucose. Un grand nombre de preuves indiquent que les propriétés du glycogène telles que la digestibilité et la solubilité dans l’eau sont corrélées à la longueur moyenne de la chaîne (LCA), qui dictera ensuite le pourcentage de points de ramification et la taille des particules 2,6,7,8,10,11 . L’ACL est définie par le rapport entre le nombre total de résidus de glucose et le nombre de points de ramification. En règle générale, les valeurs du LCA varient de 11 à 14 et de 7 à 23 résidus de glucose chez les eucaryotes et les procaryotes, respectivement10. Chez l’homme, plusieurs maladies du trouble du glycogène sont dues à une accumulation anormale de glycogène. Par exemple, la maladie d’Andersen est associée à l’activité déficiente d’une enzyme de ramification du glycogène, entraînant l’accumulation de glycogène11 anormal. Chez les procaryotes, des études cumulatives suggèrent que le LCA est un facteur critique ayant un impact sur le taux de dégradation du glycogène et la capacité de survie bactérienne12,13. Il a été rapporté que les bactéries synthétisant des particules de β avec une faible valeur ACL se dégradent plus lentement et résistent donc plus longtemps aux conditions de famine. Ainsi, la connaissance de l’architecture des particules de β est essentielle pour comprendre la formation de particules de glycogène anormales dans les maladies de stockage du glycogène humain et la survie des procaryotes dans un environnement déficient en nutriments.
Depuis le premier isolement du glycogène du foie de chien par le physiologiste Français Claude Bernard à la fin du XIXe siècle14, de nombreuses techniques ont été développées pour caractériser en détail les particules de glycogène. Par exemple, la microscopie électronique à transmission pour la morphologie du glycogène (particules α ou β)15, la spectrométrie proton-RMN pour déterminer le pourcentage de liaisons α-1,616, la chromatographie d’exclusion de taille avec multi-détecteurs pour déduire le poids moléculaire, l’électrophorèse glucidique assistée par fluorophore (FACE)17 ou la chromatographie par échange d’anions à haute performance avec détection ampérométrique pulsée (HPAEC-PAD) pour la distribution de longueur de chaîne (CLD) et le LCA détermination18.
Ce travail se concentre sur la méthode d’électrophorèse des glucides assistée par fluorophore, qui repose sur l’amination réductrice du groupe hémiacétal par fonction amine primaire. Historiquement, l’acide 8-amino-1,3,6-naphtalène trisulfonique (ANTS) a d’abord été utilisé pour le marquage. Plus tard, il a été remplacé par le fluorophore plus sensible, l’acide 8-amino 1,3,6 pyrène trisulfonique (APTS)19.
Figure 1 : La réaction d’amination réductrice avec l’acide 8-amino 1,3,6 pyrène trisulfonique (APTS). Réaction d’amination réductrice du groupe hémiacétal par fonction amine primaire de l’acide 8-amino 1,3,6 pyrène trisulfonique (APTS) dans des conditions réductrices Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Comme illustré à la figure 1, la fonction hémiacétal de l’extrémité réductrice d’une chaîne glucane interagit avec l’amine primaire de l’APTS dans des conditions réductrices. Les groupes sulfoniques d’APTS portent des charges négatives qui permettent la séparation des chaînes de glucanes en fonction de leur degré de polymérisation (DP). La réaction réductrice de l’amine est hautement reproductible et efficace. Un étiquetage d’efficacité moyen de 80% est obtenu pour DP3 à DP135 et jusqu’à 88% et 97% pour le maltose (DP2) et le glucose, respectivement17,20. Parce qu’une molécule d’APTS réagit avec l’extrémité réductrice de chaque chaîne glucane, les chaînes individuelles pourraient être quantifiées et comparées les unes aux autres sur une base molaire.
Les propriétés physico-chimiques des particules de glycogène (p. ex. taille, morphologie, solubilité) sont directement associées à la longueur des glucanes composant les particules. Tout déséquilibre entre les enzymes biosynthétiques et cataboliques entraîne l’altération de la distribution de la longueur de la chaîne et, en soi, l’accumulation de glycogène anormal qui peut être dangereux pour la cellule11. L’analyse FACE est une méthode de choix pour déterminer la distribution de la longueur de chaîne (CLD) du glycogène. Comme le montre la figure 2, la détermination de la CLD permet d’inférer la valeur moyenne de la longueur de chaîne du glycogène (LCA), qui reflète la structure des particules de glycogène. Les glycogènes animaux avec des valeurs élevées de LCA sont associés à l’apparition de particules anormales. L’analyse soustractive est une méthode utile pour comparer deux échantillons de glycogène de différents milieux génétiques (mutant ou type sauvage). En traçant sur une échelle logarithmique les CLD normalisés au pic maximal, en revanche, ont l’avantage de comparer les CLD indépendamment d’une référence et nous donnent des informations sur le mécanisme croissant du glycogène.
De plus, l’analyse FACE est une technique puissante pour caractériser les propriétés catalytiques des enzymes métabolisant le glycogène. Par exemple, toutes les enzymes de ramification du glycogène clivent (1 → 4) les liaisons α et transfèrent des groupes oligomaltosyles sur une position (1 → 6) -α ou des points de ramification. Les enzymes ramifiées se distinguent par leur affinité pour les polysaccharides (par exemple, l’amylopectine, le glycogène) et la longueur des glucanes transférés malgré le mécanisme catalytique similaire22. Ainsi, diverses sources d’enzymes ramifiées (humaines, végétales, bactériennes) peuvent être caractérisées et classées grâce à une série d’expériences d’incubation et de comparaisons CLD à l’aide de l’analyse FACE23.
Comme mentionné dans l’introduction, HPAEC-PAD est également une méthode alternative pour déterminer la distribution de longueur de chaîne18. Les deux techniques nécessitent l’hydrolyse complète des liaisons (1 → 6)-α ou des points de ramification par des enzymes de débranchement de type isoamylase avant de séparer le pool de glucanes linéaires en fonction de leur degré de polymérisation (DP). Cependant, la méthode HPAEC-PAD présente deux inconvénients par rapport à FACE: (1) la réponse ampérométrique de l’impulsion diminue à mesure que les chaînes de glucanes augmentent, ce qui ne fournit pas d’informations quantitatives. Ce problème de biais de masse peut être contourné en utilisant HPAEC-ENZ-PAD qui implique un réacteur enzymatique post-colonne entre la colonne d’échange d’anions et PAD24. Le réacteur enzymatique de colonne hydrolyse les malto-oligosaccharides en résidus de glucose permettant une réponse ampérométrique d’impulsion constante. (2) Le HPAEC-PAD permet la séparation des chaînes de glucanes avec un degré de polymérisation allant jusqu’à 70. Bien que la résolution soit suffisante pour déterminer le CLD des échantillons de glycogène, FACE sépare les chaînes avec des DP jusqu’à 150, ce qui convient aux échantillons d’amidon17. Il est essentiel de garder à l’esprit que l’analyse HPAEC-PAD et FACE a des avantages et des inconvénients. Par exemple, la réaction d’amination nécessite un groupe hémiacétal libre pour réagir avec la fonction amine primaire de l’APTS. Cela implique que l’étiquetage APTS ne peut pas être utilisé pour les chaînes de glucane dépourvues d’extrémités réductrices (par exemple, l’inuline). La méthode HPAEC-PAD ne nécessite pas la présence d’extrémités réductrices. Un deuxième aspect intéressant de la méthode HPAEC-PAD est que la colonne d’échange d’anions peut être chargée de quelques milligrammes de glucanes linéaires, permettant la purification du malto-oligosaccharide avec un DP spécifique ou 14C-radiomarqué malto-oligosaccharide pour le dosage enzymatique 18,25. Enfin, bien que la spectrométrie de masse (p. ex. MALDI-TOF) soit une technique rapide et sensible pour déterminer la distribution de la longueur de la chaîne, cette technique semble être moins reproductible. Il surestime la quantité de longues chaînes de glucane26. Néanmoins, ce dernier peut être utilisé pour une application spécifique telle que l’imagerie MALDI pour cartographier la présence de glycogène à travers le tissu cellulaire27.
The authors have nothing to disclose.
Ces travaux ont été soutenus par le CNRS, l’Université de Lille CNRS, et les bourses ANR « MathTest » (ANR-18-CE13-0027).
AG-501-X8 Resin | BioRad | #1436424 | Storage Room temperature |
100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8 | Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature. | ||
APTS stock solution | Merck | 09341-5MG | Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C. |
Capillary | Sciex Separations, Les Ulis, France | ||
Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623 | Thermofisher | select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min. |
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Excel | Microsoft | Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph. | |
Free-Dry apparatus | Christ | alpha 2-4 LO plus | before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h. |
Isoamylase | Megazyme | E-ISAMY | 180 U/mg of protein |
Maltoheptaose | Merck | M7753 | |
N-Linked carbohydrate separation buffer | Sciex Separations, Les Ulis, France | 477623 | Storage at 4 °C |
Pullulanase | Megazyme | E-PULKP | 30 U/mg of protein |
Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296813-100ML | 1 M Sodium cyanoborohydride in THF |
Vaccum-evaporator | Eppendorf | Concentrator 5301 | Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried |