Isolierung von kultivierbaren Hefen und Schimmelpilzen aus Böden zur Untersuchung der Pilzpopulationsstruktur
Summary
Dieses Protokoll ist eine effektive, schnelle Methode, um Hefen und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus aus großen Sätzen von Bodenproben in nur 7 Tagen zu kultivieren. Die Methoden können leicht modifiziert werden, um eine Reihe von Inkubationsmedien und Temperaturen aufzunehmen, die für Experimente benötigt werden.
Abstract
Der Boden beherbergt eine unglaubliche Menge an mikrobiellem Leben, wobei jedes Gramm bis zu Milliarden von bakteriellen, archaealen und Pilzzellen enthält. Mehrzellige Pilze wie Schimmelpilze und einzellige Pilze, die allgemein als Hefen definiert werden, spielen in Bodenökosystemen eine wesentliche Rolle als Zersetzer von organischem Material und als Nahrungsquellen für andere Bodenbewohner. Die Vielfalt der Pilzarten im Boden hängt von einer Vielzahl von klimatischen Faktoren wie Niederschlag und Temperatur sowie von Bodeneigenschaften wie organischer Substanz, pH-Wert und Feuchtigkeit ab. Das Fehlen angemessener Umweltproben, insbesondere in Regionen Asiens, Afrikas, Südamerikas und Mittelamerikas, behindert die Charakterisierung von Bodenpilzgemeinschaften und die Entdeckung neuartiger Arten.
Wir charakterisierten Bodenpilzgemeinschaften in neun Ländern auf sechs Kontinenten anhand von ~ 4.000 Bodenproben und einem im Labor entwickelten Protokoll zur Isolierung von Hefen und Schimmelpilzen. Dieses Protokoll beginnt mit einer separaten selektiven Anreicherung für Hefen und den medizinisch relevanten Schimmelpilz Aspergillus fumigatus in flüssigen Medien unter Hemmung des Bakterienwachstums. Resultierende Kolonien werden dann in feste Medien übertragen und weiterverarbeitet, um Reinkulturen zu erhalten, gefolgt von einer nachgelagerten genetischen Charakterisierung. Die Identität der Hefespezies wird durch Sequenzierung ihrer internen transkribierten Spacer (ITS) -Region des nukleären ribosomalen RNA-Genclusters festgestellt, während die globale Populationsstruktur von A. fumigatus mittels Mikrosatelliten-Markeranalyse untersucht wird.
Das Protokoll wurde erfolgreich angewendet, um Bodenhefe- und A. fumigatus-Populationen in Kamerun, Kanada, China, Costa Rica, Island, Peru, Neuseeland und Saudi-Arabien zu isolieren und zu charakterisieren. Diese Ergebnisse zeigten dringend benötigte Einblicke in globale Muster in der Bodenhefediversität sowie in die globale Populationsstruktur und antimykotische Resistenzprofile von A. fumigatus. In diesem Beitrag wird die Methode zur Isolierung von Hefen und A. fumigatus aus internationalen Bodenproben vorgestellt.
Introduction
Pilze in Bodenökosystemen spielen eine wesentliche Rolle bei der Zersetzung organischer Stoffe, dem Nährstoffkreislauf und der Bodendüngung1. Sowohl kulturunabhängige (d.h. Hochdurchsatz-Sequenzierung) als auch kulturabhängige Ansätze werden häufig bei der Untersuchung von Bodenpilzen 2,3 eingesetzt. Während die große Datenmenge, die durch die Hochdurchsatz-Metabarcode-Sequenzierung generiert wird, nützlich ist, um breit angelegte Muster in der Gemeinschaftsstruktur und -diversität aufzuklären, kann der kulturabhängige Ansatz sehr komplementäre Informationen über die taxonomischen und funktionellen Strukturen von Pilzgemeinschaften sowie spezifischere Profile einzelner Organismen durch nachgelagerte Diversitäts- und Funktionsanalysen aufgrund der Verfügbarkeit reiner Pilzkulturen liefern.
Obwohl sie selten Tausende von Zellen pro Gramm Boden überschreiten, sind Hefen, die allgemein als einzellige Pilze definiert werden, essentielle Zersetzer und Nahrungsquellen für andere Bodenbewohner 4,5. Tatsächlich können Hefen die vorherrschenden Bodenpilze in kalten Biosphären wie der kontinentalen Antarktissein 6,7. Der Boden ist auch ein primäres Reservoir für medizinisch relevante Hefen, die beim Menschen und anderen Säugetieren schwere opportunistische Infektionen verursachen8. Trotz morphologischer Ähnlichkeiten sind Hefearten phylogenetisch vielfältig und kommen unter filamentösen Pilzen in zwei Hauptstämmen, Ascomycota und Basidiomycota, innerhalb des Pilzreichs9 vor. Hefen fehlt eine definierende DNA-Signatur am pilzlichen Barcoding-Gen, der internen transkribierten Spacer-Region (ITS) des nukleären ribosomalen RNA-Genclusters10, was sie in metagenomischen Untersuchungen nicht von anderen Pilzen unterscheidbar macht und daher den Einsatz kulturabhängiger Methoden zur Isolierung von Hefearten erfordert.
Das folgende Protokoll wurde implementiert, um Bodenhefegemeinschaften von neun Ländern zu charakterisieren und globale Trends und Muster in der Bodenhefediversitätzu identifizieren 9,11,12. Metagenomik-Ansätze sind von begrenztem Nutzen bei der Untersuchung von Zielgruppen von Organismen wie Hefen 2,3. Aufgrund ihrer phylogenetischen Vielfalt können Hefen allein aufgrund der DNA-Sequenz nicht von anderen Pilzen unterschieden werden. Daher erfordert die Untersuchung von Hefepopulationen die fortgesetzte Verwendung einer kulturabhängigen Isolation. Die Kultivierung ist jedoch oft deutlich zeitaufwendiger und erfordert mehr Personal, um die Experimente durchzuführen. Daher wurde das Protokoll für eine schnellere Verarbeitung mit begrenztem Personal optimiert und optimiert. Der Hauptvorteil der Kultivierung besteht darin, dass die identifizierten Hefearten lebende Hefen und keine toten sind und daher eher echte Bodenbewohner als vorübergehende Zellen in den Böden sind. Es wurde geschätzt, dass etwa 40% der Pilz-DNA im Boden entweder Verunreinigungen aus anderen Umgebungen, extrazellulär sind oder aus Zellen stammen, die nicht mehr intakt sind, was dazu führt, dass Hochdurchsatz-Sequenzierungsansätze den Pilzreichtum um bis zu 55% überschätzen13. Kulturabhängige Isolierung kann die Identität von Hefearten leicht bestätigen, mit dem zusätzlichen Vorteil, dass die Reinkultur für die Verwendung in nachgelagerten Analysen gesichert wird. Tatsächlich wurden Reinkulturen von 44 mutmaßlichen neuen Hefearten unter Verwendung dieses Bodenisolationsprotokolls identifiziert, das die Verwendung einer Reihe von Methoden zur detaillierten Untersuchung ihrer taxonomischen und funktionellen Eigenschaftenermöglichte 14.
Das folgende Protokoll kann auch verwendet werden, um im Boden vorhandene Formen wie A. fumigatus zu isolieren. Aspergillus fumigatus ist ein thermophiler und saprophytischer Schimmelpilz mit einer weiten, globalen Verbreitung im Boden15. Es wurde aus zahlreichen klinischen und nicht-klinischen Umgebungen isoliert. Nicht-klinische Probenahmen umfassen üblicherweise Luft, organische Ablagerungen (Kompost, Sägestaub, Tulpenzwiebelabfälle) und Boden (landwirtschaftliche, gartenbezogene und natürliche Böden) 16,17,18,19. Aspergillus fumigatus ist ein humaner opportunistischer Erreger, der eine Reihe von Infektionen verursacht, die zusammen als Aspergillose bezeichnet werden und über 8 Millionen Menschen weltweitbetreffen 16,20. Etwa 300.000 Menschen auf der ganzen Welt leiden an invasiver Aspergillose, der schwersten Form der Aspergillose16. Abhängig von Faktoren wie der Patientenpopulation, dem Infektionsort und der Wirksamkeit der antimykotischen Therapie kann die Sterblichkeitsrate bis zu 90% betragen. In den letzten Jahrzehnten hat die Resistenz gegen antimykotische Therapien zugenommen, was globale Überwachungsbemühungen sowohl in klinischen als auch in Umweltpopulationen erfordert, um diese Resistenzgenotypen21,22,23 zu verfolgen. Aufgrund seiner Fähigkeit, bei Temperaturen von über 50 ° C zu wachsen, kann diese Temperatur genutzt werden, um A. fumigatus-Isolate aus dem Boden mit kulturabhängigen Methoden auszuwählen. Aspergillus fumigatus-Isolate werden üblicherweise an neun hochpolymorphen STR-Loci (Short Tandem Repeat) genotypisiert, von denen gezeigt wird, dass sie eine hohe Unterscheidungskraft zwischen den Stämmenaufweisen 24. Diese STR-Genotypen können mit anderen zuvor untersuchten Populationen verglichen werden, um die Ausbreitung von A. fumigatus-Genotypen, einschließlich Arzneimittelresistenzgenen, auf der ganzen Welt zu verfolgen.
Im Folgenden beschreiben wir ein Protokoll zur schnellen Isolation von Hefen und A. fumigatus aus Bodenproben in kulturabhängiger Weise. Abhängig von der Menge an Boden, die pro Probe erhalten wird, können die Bodenproben zwischen den beiden Protokollen geteilt werden. Im Vergleich zu ähnlichen Methoden, die Hefe und A. fumigatus aus dem Boden isolieren, verwendet dieses Protokoll 10x weniger Boden pro erhaltenem Isolat. Studien, die versuchen, A. fumigatus aus dem Boden zu isolieren, erfordern zwischen 1 und 2 g Boden pro Isolat, während dieses Protokoll nur 0,1-0,2 g Boden18,19,25 erfordert. Dieses Protokoll verwendet kleinere Kunststoffe und Behälter, die das Hochdurchsatzdesign erleichtern. Daher kann eine größere Anzahl von Proben mit weniger Platz für Geräte wie Inkubatoren und Walzentrommeln verarbeitet werden. Bodenproben können in nur 7 Tagen vollständig verarbeitet werden, um Isolate zu erhalten. Dieses Protokoll wurde optimiert, um die Verarbeitung von bis zu 150-200 Proben pro Tag und Person zu ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das für die Isolierung von Hefen und A. fumigatus aus dem Boden entwickelte Protokoll ist eine schnelle und effiziente Methode zur Hochdurchsatz-Bodenbearbeitung und Pilzisolation. Das Protokoll erfordert nur eine geringe Menge Boden (0,1-0,2 g) pro Probe, so dass mehr Standorte mit ähnlichem Aufwand beprobt werden können. Die schnelle Durchlaufzeit stellt sicher, dass die Ergebnisse innerhalb eines kurzen Zeitrahmens erzielt werden können, und lässt Zeit für die Fehlerbehebung und bei Bedarf wiederholte E…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch Zuschüsse des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant No. ALLRP 570780-2021) und McMaster University.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt Inc | 72.690.001 | |
| Benomyl powder | Toronto Research Chemicals | B161380 | |
| Chloramphenicol powder | Sigma-Aldrich | SKU: C0378-5G | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | SKU: D9434-500G | |
| Fragment Analysis Software | NCBI's Osiris | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/ | |
| ITS sequence database | NCBI GenBank | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ | |
| ITS sequence database | UNITE | https://unite.ut.ee/ | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | SKU: P5905-500G | |
| Reusable cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-12 | |
| Sterile 10 cm diameter Petri dishes | Sarstedt Inc | 83.3902 | |
| Sterile 13 mL culture tubes | Sarstedt Inc | 62.515.006 | |
| Wooden plain-tipped applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | SKU: Y1625-250G |
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