Schneller Golgi-Fleck für die Visualisierung der dendritischen Wirbelsäule im Hippocampus und im präfrontalen Kortex
Summary
Das Protokoll beschreibt eine Modifikation der schnellen Golgi-Methode, die an jeden Teil des Nervensystems angepasst werden kann, zur Färbung von Neuronen im Hippocampus und im medialen präfrontalen Kortex der Ratte.
Abstract
Die Golgi-Imprägnierung unter Verwendung des Golgi-Färbesets mit geringfügigen Anpassungen wird verwendet, um dendritische Stacheln im Hippocampus der Ratte und im medialen präfrontalen Kortex zu imprägnieren. Diese Technik ist eine deutliche Verbesserung gegenüber früheren Methoden der Golgi-Imprägnierung, da die vorgemischten Chemikalien sicherer zu verwenden sind, Neuronen durchweg gut imprägniert sind, es viel weniger Hintergrundablagerungen gibt und für eine bestimmte Region extrem kleine Abweichungen in der Wirbelsäulendichte zwischen den Experimenten auftreten. Darüber hinaus können Gehirne ab einem bestimmten Punkt akkumuliert und bis zur Weiterverarbeitung eingefroren gehalten werden. Mit dieser Methode kann jede interessierende Hirnregion untersucht werden. Nach der Färbung und dem Verrutschen der Abdeckung wird die dendritische Wirbelsäulendichte bestimmt, indem die Anzahl der Stacheln für eine Länge von Dendrit gezählt und als Wirbelsäulendichte pro 10 μm Dendrit ausgedrückt wird.
Introduction
Die Methode, Kaliumdichromat und Silbernitrat zur Markierung von Neuronen zu verwenden, wurde zuerst von Camillo Golgi1,2 beschrieben und anschließend von Santiago Ramon y Cajal verwendet, um eine immense Arbeit zur Unterscheidung neuronaler und glialer Subtypen zu produzieren. Ein kürzlich erschienenes Buch mit seinen Illustrationen ist jetzterhältlich 3. Nach den Studien von Ramon y Cajal, die vor mehr als 100 Jahren veröffentlicht wurden, wurde nur sehr wenig Golgi-Imprägnierung verwendet. Die Golgi-Imprägnierung ist ein mühsamer Prozess, der die dreidimensionale Visualisierung von Neuronen mit einem Lichtmikroskop ermöglicht. Es gab im Laufe der Jahre zahlreiche Modifikationen der Golgi-Methode, um die Methode zu erleichtern und die Färbung konsistenterzu machen 4. 1984 beschrieben Gabbott und Somogyi5 das einteilige Golgi-Imprägnierverfahren, das eine schnellere Verarbeitung ermöglichte. Diese Golgi-Imprägniermethode erfordert eine Perfusion mit 4% Paraformaldehyd und 1,5% Picrinsäure, gefolgt von der Vibratom-Schnitt in ein Bad aus 3% Kaliumdichromat. Abschnitte werden auf Glasobjektträger montiert, die vier Ecken der Deckgläser so verklebt, dass beim Eintauchen in Silbernitrat die Diffusion allmählich erfolgt. Anschließend werden Deckgläser abgenommen, Abschnitte dehydriert und schließlich mit Montagemedium dauerhaft verrutscht. Diese Technik wurde erfolgreich eingesetzt, um Neuronen und Glia 6,7,8 im Hippocampus zu markieren. Die hier beschriebene schnelle Golgi-Methode ist eine Verbesserung, da sowohl Kaliumdichromat als auch Silbernitrat weitaus geringer ausgesetzt sind und kein Paraformaldehyd und keine Pikrinsäure verwendet werden. Obwohl Zellen, die mit Modifikationen der Gabbott- undSomogyi-5-Methode imprägniert wurden, analysiert werden konnten, waren die Abschnitte während des Dehydratisierungsschritts oft über- oder unterbelichtet oder fielen von den Objektträgern und im Allgemeinen mussten mehrere Experimente gepoolt werden, um genügend Zellen für die Analyse zu haben.
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Verwendung des Golgi-Färbesets (siehe Materialtabelle) zur Kennzeichnung von Dendriten und dendritischen Stacheln im Hippocampus und im medialen präfrontalen Kortex (mPFC) der Ratte. Die Vorteile dieser Methode gegenüber früheren sind, dass sie schnell ist, es weniger Exposition gegenüber schädlichen Chemikalien für den Forscher gibt und es eine konsistente Färbung von Neuronen gibt. Das unten beschriebene Protokoll wurde mit geringfügigen Modifikationen verwendet, um die dendritische Wirbelsäulendichte im Hippocampus und mPFC der Ratte in vielen Studien 9,10,11,12,13,14,15 zu beurteilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode der Golgi-Imprägnierung, die eine schnelle gleichzeitige Verarbeitung vieler Abschnitte ermöglicht. Es ist eine Verbesserung gegenüber zuvor beschriebenen5 arbeitsintensiveren Methoden und liefert durchweg imprägnierte Neuronen für die Analyse. Darüber hinaus ist die Exposition gegenüber giftigen Chemikalien, die bei der Golgi-Imprägnierung verwendet werden, geringer. Der schwierigste Teil des Prozesses besteht darin, die Abschnitte auf den…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Sacred Heart University Undergraduate Research Initiative unterstützt.
Materials
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
Riferimenti
- Pannese, E. The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences. Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).
- Bentivoglio, M., et al. The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3 (2019).
- Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. . The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal. , 208 (2017).
- Dall’Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. The "single-section" Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The ‘single’ section Golgi-impregnation procedure: methodological description. Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone. Glia. 3 (4), 283-292 (1990).
- Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).
- Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).
- Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat. Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).
- Frankfurt, M., Luine, V. The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol. Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).
- Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age. Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).
- Bowman, R. E., et al. Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats. Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).
- Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats. Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).
- Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines. Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).
- Jacome, L. F., et al. Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats. Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).
- Frankfurt, M. Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory. Research Features. , (2021).
- Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex. Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).
- Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats. Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).
- Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood. Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).
- Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density. Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).
- Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia. Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).
- Zemmar, A., et al. Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex. Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).
