Macchia rapida di Golgi per la visualizzazione della colonna vertebrale dendritica nell'ippocampo e nella corteccia prefrontale
Summary
Il protocollo descrive una modifica del metodo rapido Golgi, che può essere adattato a qualsiasi parte del sistema nervoso, per la colorazione dei neuroni nell’ippocampo e nella corteccia prefrontale mediale del ratto.
Abstract
L’impregnazione di Golgi, utilizzando il kit di colorazione Golgi con piccoli adattamenti, viene utilizzata per impregnare le spine dendritiche nell’ippocampo del ratto e nella corteccia prefrontale mediale. Questa tecnica è un netto miglioramento rispetto ai precedenti metodi di impregnazione di Golgi perché le sostanze chimiche premiscelate sono più sicure da usare, i neuroni sono costantemente ben impregnati, ci sono molti meno detriti di fondo e, per una data regione, ci sono deviazioni estremamente piccole nella densità della colonna vertebrale tra gli esperimenti. Inoltre, i cervelli possono essere accumulati dopo un certo punto e mantenuti congelati fino a un’ulteriore elaborazione. Usando questo metodo qualsiasi regione del cervello di interesse può essere studiata. Una volta macchiata e la copertura scivolata, la densità della colonna vertebrale dendritica viene determinata contando il numero di spine per una lunghezza di dendrite ed espressa come densità della colonna vertebrale per dendrite da 10 μm.
Introduction
Il metodo di utilizzo del dicromato di potassio e del nitrato d’argento per etichettare i neuroni è stato descritto per la prima volta da Camillo Golgi 1,2 e successivamente utilizzato da Santiago Ramon y Cajal per produrre un immenso corpo di lavoro che differenzia i sottotipi neuronali e gliali. Un libro pubblicato di recente con le sue illustrazioni è ora disponibile3. Seguendo gli studi di Ramon y Cajal, pubblicati più di 100 anni fa, è stata utilizzata pochissima impregnazione di Golgi. L’impregnazione di Golgi è un processo laborioso che consente la visualizzazione tridimensionale dei neuroni con un microscopio ottico. Ci sono state numerose modifiche del metodo Golgi nel corso degli anni per rendere il metodo più facile e la colorazione più coerente4. Nel 1984, Gabbott e Somogyi5 descrissero la procedura di impregnazione del Golgi a sezione singola che consentiva un’elaborazione più rapida. Questo metodo di impregnazione del Golgi richiede la perfusione con il 4% di paraformaldeide e l’1,5% di acido picrico, post-fissazione seguita da sezionamento del vibratoma in un bagno di dicromato di potassio al 3%. Le sezioni sono montate su vetrini, i quattro angoli dei coperchi incollati in modo che quando immersi nel nitrato d’argento, la diffusione sia graduale. Le coperture vengono quindi staccate, le sezioni vengono disidratate e alla fine la copertura scivola permanentemente con il mezzo di montaggio. Questa tecnica è stata utilizzata con successo per etichettare neuroni e glia 6,7,8 nell’ippocampo. Il metodo rapido Golgi qui descritto è un miglioramento perché c’è molta meno esposizione sia al dicromato di potassio che al nitrato d’argento e non vengono utilizzati paraformaldeide e acido picrico. Inoltre, sebbene le cellule che sono state impregnate utilizzando modifiche del metodo Gabbott e Somogyi5 potessero essere analizzate, spesso le sezioni erano sovra o sottoesposte o cadevano dai vetrini durante la fase di disidratazione e, in generale, diversi esperimenti dovevano essere raggruppati per avere abbastanza cellule per l’analisi.
Il presente protocollo descrive l’uso del kit di colorazione Golgi (vedi Tabella dei materiali) per etichettare dendriti e spine dendritiche nell’ippocampo e nella corteccia prefrontale mediale (mPFC) del ratto. I vantaggi di questo metodo rispetto ai precedenti sono che è rapido, c’è meno esposizione a sostanze chimiche nocive per il ricercatore e c’è una colorazione costante dei neuroni. Il protocollo descritto di seguito è stato utilizzato con piccole modifiche per valutare la densità della colonna vertebrale dendritica nell’ippocampo e nella mPFC del ratto in molti studi 9,10,11,12,13,14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente protocollo descrive un metodo di impregnazione del Golgi che consente una rapida elaborazione simultanea di molte sezioni. È un miglioramento rispetto ai5 metodi più laboriosi descritti in precedenza e produce costantemente neuroni impregnati per l’analisi. Inoltre, c’è meno esposizione alle sostanze chimiche tossiche utilizzate nell’impregnazione di Golgi. La parte più impegnativa del processo è ottenere che le sezioni siano piatte sulle diapositive, il che richiede una notevole …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants.
Materials
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
Riferimenti
- Pannese, E. The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences. Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).
- Bentivoglio, M., et al. The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3 (2019).
- Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. . The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal. , 208 (2017).
- Dall’Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. The "single-section" Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The ‘single’ section Golgi-impregnation procedure: methodological description. Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone. Glia. 3 (4), 283-292 (1990).
- Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).
- Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).
- Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat. Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).
- Frankfurt, M., Luine, V. The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol. Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).
- Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age. Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).
- Bowman, R. E., et al. Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats. Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).
- Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats. Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).
- Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines. Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).
- Jacome, L. F., et al. Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats. Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).
- Frankfurt, M. Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory. Research Features. , (2021).
- Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex. Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).
- Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats. Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).
- Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood. Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).
- Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density. Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).
- Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia. Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).
- Zemmar, A., et al. Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex. Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).
