Tinción rápida de Golgi para la visualización de la columna dendrítica en el hipocampo y la corteza prefrontal
Summary
El protocolo describe una modificación del método rápido de Golgi, que se puede adaptar a cualquier parte del sistema nervioso, para teñir las neuronas en el hipocampo y la corteza prefrontal medial de la rata.
Abstract
La impregnación de Golgi, utilizando el kit de tinción de Golgi con adaptaciones menores, se utiliza para impregnar espinas dendríticas en el hipocampo de la rata y la corteza prefrontal medial. Esta técnica es una mejora notable con respecto a los métodos anteriores de impregnación de Golgi porque los productos químicos premezclados son más seguros de usar, las neuronas están consistentemente bien impregnadas, hay muchos menos desechos de fondo y, para una región determinada, hay desviaciones extremadamente pequeñas en la densidad de la columna vertebral entre los experimentos. Además, los cerebros se pueden acumular después de un cierto punto y mantenerse congelados hasta su posterior procesamiento. Usando este método se puede estudiar cualquier región del cerebro de interés. Una vez teñida y cubierta deslizada, la densidad de la columna dendrítica se determina contando el número de espinas para una longitud de dendrita y se expresa como densidad de la columna vertebral por dendrita de 10 μm.
Introduction
El método de uso de dicromato de potasio y nitrato de plata para etiquetar las neuronas fue descrito por primera vez por Camillo Golgi 1,2 y posteriormente utilizado por Santiago Ramón y Cajal para producir un inmenso cuerpo de trabajo diferenciando subtipos neuronales y gliales. Un libro recientemente publicado con sus ilustraciones ya está disponible3. Siguiendo los estudios de Ramón y Cajal, que se publicaron hace más de 100 años, se utilizó muy poca impregnación de Golgi. La impregnación de Golgi es un proceso laborioso que permite la visualización tridimensional de las neuronas con un microscopio de luz. Ha habido numerosas modificaciones del método golgi a lo largo de los años para facilitar el método y la tinción más consistente4. En 1984, Gabbott y Somogyi5 describieron el procedimiento de impregnación de Golgi de sección única que permitió un procesamiento más rápido. Este método de impregnación de Golgi requiere perfusión con 4% de paraformaldehído y 1,5% de ácido pícrico, después de la fijación seguida de seccionamiento de vibratomo en un baño de dicromato de potasio al 3%. Las secciones se montan en toboganes de vidrio, las cuatro esquinas de los cubrehojas se pegan para que cuando se sumergen en nitrato de plata, la difusión sea gradual. Los cubrehojas se desprenden, las secciones se deshidratan y, finalmente, la cubierta se desliza permanentemente con el medio de montaje. Esta técnica se utilizó con éxito para etiquetar neuronas y glía 6,7,8 en el hipocampo. El método rápido de Golgi descrito aquí es una mejora porque hay mucha menos exposición tanto al dicromato de potasio como al nitrato de plata y no se utilizan paraformaldehído ni ácido pícrico. Además, aunque las células que se impregnaron utilizando modificaciones del método Gabbott y Somogyi5 pudieron analizarse, a menudo las secciones estaban sobreexpuestas o subexpuestas o se caían de los toboganes durante la etapa de deshidratación y, en general, se tuvieron que agrupar varios experimentos para tener suficientes células para el análisis.
El presente protocolo describe el uso del kit de tinción de Golgi (ver Tabla de materiales) para etiquetar dendritas y espinas dendríticas en el hipocampo y la corteza prefrontal medial (mPFC) de la rata. Las ventajas de este método sobre los anteriores son que es rápido, hay menos exposición a sustancias químicas nocivas para el investigador y hay una tinción constante de neuronas. El protocolo descrito a continuación se ha utilizado con modificaciones menores para evaluar la densidad de la columna dendrítica en el hipocampo y mPFC de la rata en muchos estudios 9,10,11,12,13,14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente protocolo describe un método de impregnación de Golgi que permite el procesamiento simultáneo rápido de muchas secciones. Es una mejora con respecto alos 5 métodos más intensivos en mano de obra descritos anteriormente y produce constantemente neuronas impregnadas para su análisis. Además, hay menos exposición a productos químicos tóxicos utilizados en la impregnación de Golgi. La parte más desafiante del proceso es lograr que las secciones sean planas en las diapositivas,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants.
Materials
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
Riferimenti
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