Primaire menselijke neusepitheelcellen: biobanking in de context van precisiegeneeskunde
Summary
Hier beschrijven we de isolatie, versterking en differentiatie van primaire menselijke nasale epitheelcellen (HNE) op het lucht-vloeistofinterface en een biobankingprotocol dat het mogelijk maakt om met succes versterkte HNE te bevriezen en vervolgens te ontdooien. Het protocol analyseert elektrofysiologische eigenschappen van gedifferentieerde HNE-cellen en CFTR-gerelateerde chloridesecretiecorrectie bij verschillende modulatorbehandelingen.
Abstract
Menselijke nasale epitheelcellen (HNE) zijn gemakkelijk te verzamelen door eenvoudig, niet-invasief neusborstelen. Patiënt-afgeleide primaire HNE-cellen kunnen worden versterkt en gedifferentieerd tot een pseudo-gestratificeerd epitheel in lucht-vloeistof interfaceomstandigheden om cyclisch AMP-gemedieerd chloride (Cl–) transport te kwantificeren als een index van cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) functie. Als kritieke stappen zoals de kwaliteit van nasaal borstelen en celdichtheid bij cryopreservatie efficiënt worden uitgevoerd, kunnen HNE-cellen met succes worden gebiobankeerd. Bovendien tonen kortsluitstroomstudies aan dat vries-ontdooien de elektrofysiologische eigenschappen en respons van HNE-cellen op CFTR-modulatoren niet significant wijzigt. In de kweekomstandigheden die in deze studie worden gebruikt, wanneer minder dan 2 x 106 cellen per cryoviaal worden ingevroren, is het faalpercentage zeer hoog. We raden aan om minimaal 3 x 106 cellen per cryoviaal in te vriezen. We tonen aan dat dubbele therapieën die een CFTR-corrector combineren met een CFTR-potentiator een vergelijkbare correctie-werkzaamheid hebben voor CFTR-activiteit in F508del-homozygote HNE-cellen. Drievoudige therapie VX-445 + VX-661 + VX-770 verhoogde significant de correctie van CFTR-activiteit in vergelijking met duale therapie VX-809 + VX-770. De meting van CFTR-activiteit in HNE-cellen is een veelbelovende preklinische biomarker die nuttig is om CFTR-modulatortherapie te begeleiden.
Introduction
Cystic Fibrosis (CF) is een autosomaal recessieve aandoening als gevolg van mutaties in het Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) gen dat leidt tot de afwezigheid of disfunctie van het CFTR-eiwit, een anionkanaal gelegen aan het apicale oppervlak van epithelia 1,2. Recente ontwikkelingen in CFTR-therapie hebben de prognose van de ziekte verbeterd en de laatste goedgekeurde geneesmiddelen die CFTR-correctoren en CFTR-potentiators combineren, hebben geleid tot grote verbeteringen in de longfunctie en kwaliteit van leven voor CF-patiënten met de meest voorkomende mutatie p.Phe508del-mutatie (F508del)3,4. Ondanks deze veelbelovende therapeutische vooruitgang komt ongeveer 10% van de CF-patiënten niet in aanmerking omdat ze mutaties dragen die niet te redden zijn door deze CFTR-modulatoren. Voor deze patiënten is het nodig om andere geneesmiddelen of medicijncombinaties te testen om de meest efficiënte combinatie voor specifieke mutaties te vinden, wat het belang van gepersonaliseerde therapieën benadrukt.
Menselijke nasale epitheelcellen (HNE) zijn gemakkelijk te verzamelen door eenvoudige, niet-invasieve neusborsteling en maken kwantificering van cyclisch AMP-gemedieerd chloride (Cl−) transport als een index van CFTR-functie mogelijk. HNE-cellen leveren een nauwkeurig model van de menselijke luchtwegen, maar hun levensduur is beperkt in cultuur. Dankzij de optimalisatie van kweektechnieken kunnen patiënt-afgeleide primaire HNE-cellen voorwaardelijk worden geherprogrammeerd met Rho-geassocieerde kinaseremmer (ROCKi), versterkt en gedifferentieerd tot een pseudo-gestratificeerd epitheel in lucht-vloeistof interface (ALI) omstandigheden op microporeuze filters 5,6. Er bestaan tal van kweekprotocollen voor HNE-cultuur (in de handel verkrijgbaar, serumvrij, “zelfgemaakt”, co-kweek met feedercellen, enz.), en de keuze van media en kweekomstandigheden is beschreven om de groei, celpopulatiedifferentiatie en epitheliale functie te beïnvloeden 7,8. Het protocol presenteert hier een vereenvoudigde, feedervrije ROCKi-amplificatiemethode die het mogelijk maakt om met succes een groot aantal HNE-cellen te verkrijgen die vervolgens worden gedifferentieerd bij ALI voor CFTR-functietests.
We hebben aangetoond dat in gedifferentieerde HNE-cellen een behandeling van 48 uur met CFTR-modulatoren voldoende is om elektrofysiologische correctie van CFTR-afhankelijke Cl-stroom te induceren en dat de in vitro waargenomen correctie gecorreleerd kan zijn met de klinische verbetering van de patiënt9. HNE-cellen vormen daarom een geschikt model, niet alleen voor fundamenteel CF-onderzoek, maar ook voor preklinische studies met patiëntspecifieke CFTR-modulatortests. In deze context van gepersonaliseerde therapie was het doel van het protocol om te valideren dat gecryopreserveerde HNE-cellen van CF-patiënten, gekweekt in onze omstandigheden, een geschikt model waren voor CFTR-correctiestudies, en vergelijkbare resultaten konden worden verwacht bij het vergelijken van CFTR-afhankelijk Cl-transport van verse en bevroren ontdooide cellen. De studie beoordeelde ook de werkzaamheid van verschillende CFTR-modulatoren bij het gebruik van dubbele en drievoudige therapieën.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gebruik van patiënt-afgeleide nasale epitheelcellen als surrogaten voor menselijke bronchiale epitheelcellen (HBE) om CFTR-activiteit te meten in de context van gepersonaliseerde geneeskunde is voorgesteld als HNE de eigenschappen van cellen in cultuur reproduceren 9,11. Het sterke voordeel van HNE ten opzichte van HBE-celculturen is dat ze gemakkelijk en niet-invasief kunnen worden bemonsterd. Kortsluitstroommetingen in HNE-celculturen maken beoordeling mog…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken alle patiënten en hun families hartelijk voor hun deelname aan het onderzoek. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Franse vereniging Vaincre la Mucoviscidose; Franse vereniging ABCF 2 en Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.
Materials
| ABBV-2222 | Selleckchem | S8535 | |
| ABBV-974 | Selleckchem | S8698 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies | 12634010 | |
| Alexa 488 goat secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A11012 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290026 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody | Abcam | ab80779 | |
| Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1) | R&D Systems | MAB25031 | |
| Anti-cytokeratin 8 antibody | Progen | 61038 | |
| Anti-Muc5AC antibody | Santa Cruz Biotech | sc-20118 | |
| Anti-ZO-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-10804 | |
| Ciprofloxacin | provided by Necker Hospital Pharmacy | ||
| Colimycin | Sanofi | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Collagen type IV | Sigma-Aldrich Merck | C-7521 | |
| cytology brush | Laboratory GYNEAS | 02.104 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich Merck | D2650 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Epinephrin | Sigma-Aldrich Merck | E4375 | |
| F12-Nutrient Mixture | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Ferticult | Fertipro NV | FLUSH020 | |
| Flasks 25 | Thermo Scientific | 156.367 | |
| Flasks 75 | Thermo Scientific | 156.499 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 20104.298 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Merck | H3375 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich Merck | SLCJ0893 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich Merck | I0516 | |
| Mg2+ and Ca2+-free DPBS | Life Technologies | 14190094 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140130 | |
| Tazocillin | Mylan | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Transwell Filters | Sigma-Aldrich Merck | CLS3470-48EA | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich Merck | T8787 | |
| Trypsin 0,25% | Life Technologies | 25200056 | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| VX-445 | Selleckchem | S8851 | |
| VX-661 | Selleckchem | S7059 | |
| VX-770 | Selleckchem | S1144 | |
| VX-809 | Selleckchem | S1565 | |
| Xylocaine naphazoline 5% | Aspen France | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
Riferimenti
- Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).
- Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR. The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).
- Griese, M., et al. Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
- Liu, X., et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
- Bukowy-Bieryłło, Z. Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we. Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).
- Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).
- Noel, S., et al. Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells. The Journal of Physiology. , (2021).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Pranke, I., et al. Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).
- McDougall, C. M., et al. Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).
- Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance. PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).
- Schögler, A., et al. Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling. Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).
- Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).
- Awatade, N. T., et al. Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis. EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).
- Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
- Veit, G., et al. Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination. JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).
- Dale, T. P., Borg D’anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research. Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).
- Laselva, O., et al. Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator. The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).
- Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).
- Laselva, O., et al. Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).
