In vivo הדמיה של רקמות ביולוגיות עם פלואורסצנטיות דו-פוטונית משולבת ומיקרוסקופיה פיזור ראמאן מגורה
Summary
מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה ללא תוויות של ביומולקולות המבוססות על הרטט הפנימי שלהם של קשרים כימיים ספציפיים. בפרוטוקול זה, ההתקנה האינסטרומנטלית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי משולב של SRS ושני פוטונים מתוארת כדי לדמיין מבנים תאיים בחוט השדרה של עכברים חיים.
Abstract
מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה ללא תוויות של הרקמות הביולוגיות במיקרו-סביבה הטבעית שלה המבוססת על רטט מולקולרי מהותי, ובכך מספקת כלי מושלם לחקר vivo של תהליכים ביולוגיים ברזולוציה תת-תאית. על ידי שילוב הדמיית פלואורסצנטיות נרגשת דו-פוטונית (TPEF) במיקרוסקופ SRS, הדו-מודאלי בהדמיית vivo של רקמות יכול לרכוש מידע ביוכימי וביופיזי קריטי מנקודות מבט מרובות המסייעות בהבנת התהליכים הדינמיים הכרוכים בחילוף החומרים התאי, התגובה החיסונית ושיפוץ הרקמות וכו ‘. בפרוטוקול וידאו זה, ההתקנה של מערכת מיקרוסקופ TPEF-SRS, כמו גם את שיטת הדמיית in vivo של חוט השדרה החייתי הוא הציג. חוט השדרה, כחלק ממערכת העצבים המרכזית, ממלא תפקיד קריטי בתקשורת בין המוח למערכת העצבים ההיקפית. נדן מיאלין, השופע בפוספוליפידים, מקיף ומבודד את האקסון כדי לאפשר הולכה מלוחה של פוטנציאל פעולה. בהדמיית vivo של נדן מיאלין בחוט השדרה חשוב ללמוד את ההתקדמות של מחלות ניווניות ופגיעה בחוט השדרה. הפרוטוקול מתאר גם הכנה לבעלי חיים ושיטות הדמיה של vivo TPEF-SRS לרכישת תמונות ביולוגיות ברזולוציה גבוהה.
Introduction
ראמאן מיקרוסקופיה1,2 מתגלה כשיטה רבת עוצמה ללא תוויות לדמות רקמות ביולוגיות המבוססות על התדרים האופייניים של קשרים כימיים שונים בביומולקולות. הודות ליכולת ההדמיה הלא פולשנית והמסתגלת היטב שלה, המיקרוסקופיה של ראמאן נמצא בשימוש נרחב להדמיית רכיבים מועשרים בשומנים ברקמות ביולוגיות כמו נדן מיאלין3,4,5, אדיפוציטים6,7 וטיפות שומנים בדם8,9,10 . אות פיזור ראמאן מגורה (SRS) שנרכש כרווח ראמאן מגורה (SRG) או אובדן ראמאן מגורה (SRL) הוא ללא רקע, מראה דמיון ספקטרלי מושלם פיזור ראמאן ספונטני 11,12. בנוסף, SRL ו- SRG תלויים באופן ליניארי בריכוז הניתוח, ומאפשרים ניתוח כמותי של רכיבים ביוכימיים9,11,13. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית נרגשת דו-פוטונית (TPEF) נמצאת בשימוש נרחב להדמיה ביולוגית in vivo בשל יכולת החתך האופטית הטבועה בה, עומק החדירה העמוק והפוטוטוקסיות הנמוכה14,15,16. עם זאת, הביצועים של הדמיית TPEF תלויים במאפיינים של תגים פלואורסצנטיים, ומספר הצבעים הפתירים מוגבל עקב ספקטרום פלואורסצנטיות בפס רחב8,17,18,19. הדמיית SRS ללא תוויות והדמיה מבוססת פלואורסצנטיות TPEF הן שתי שיטות הדמיה משלימות, והשילוב ביניהן יכול לספק מידע ביופיסי וביוכימי בשפע של רקמות. שתי שיטות הדמיה אלה מבוססות שתיהן על התהליכים האופטיים הלא ליניאריים (NLO), המאפשרים אינטגרציה פשוטה במערכת מיקרוסקופ אחת. השילוב של הדמיית SRS ו- TPEF, מה שמכונה הדמיה דו-מודאלית, מאפשר הדמיה ופרופילים ממדיים גבוהים של תאים ורקמות, ומאפשר הבנה מקיפה של מערכות ביולוגיות מורכבות. באופן ספציפי, picosecond (ps) מיקרוסקופיה SRS יכול להשיג הדמיה כימית-קשר עם רזולוציה ספקטרלית גבוהה לעומת femtosecond (fs) SRS טכניקה11, המאפשר להבדיל בין רכיבים ביוכימיים מרובים ברקמה ביולוגית, במיוחד באזור טביעת האצבע הצפוף20,21. בנוסף, בהשוואה למערכת מיקרוסקופית אחרת של NLO הדו-מודאלית הנפוצה עם שילוב של מיקרוסקופ פיזור אנטי-סטוקס קוהרנטי (CARS), SRS מציג ביצועים מעולים למכוניות במונחים של פרשנות ספקטרלית ותמונה, כמו גם רגישות לזיהוי11. המיקרוסקופ SRS-TPEF שימש ככלי רב עוצמה לחקר מערכות ביולוגיות שונות, כגון Elegans Caenorhabditis9,22, מוח ראשן קסנופוס laevis5, מוח עכבר23,24, חוט השדרה25,26, עצב היקפי27, רקמת שומן7, וכו ‘.
חוט השדרה יחד עם המוח מרכיבים את מערכת העצבים המרכזית (CNS). הדמיית הפעילות התאית במערכת העצבים המרכזית במערכת העצבים המרכזית ב-vivo בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים היא קריטית להבנת המנגנונים של הפרעות במערכת העצבים המרכזית28,29,30 ולפיתוח טיפולים מקבילים31,32,33. נדן מיאלין, העוטף ומבודד אקסונים להולכה פוטנציאלית של פעולה במהירות גבוהה, ממלא תפקיד משמעותי בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית. Demyelination נחשב כסימן היכר בהפרעות חומר לבן, כגון טרשת נפוצה34. בנוסף, לאחר פגיעה בחוט השדרה35, פסולת מיאלין יכולה לווסת את הפעלת המקרופאג ‘, התורמת לדלקת כרונית ולפציעה משנית36. לכן, בהדמיית vivo של נדן מיאלין יחד עם נוירונים ותאי גליה במודלים של עכבר חי הוא לעזר רב להבין את התהליכים הדינמיים בהפרעות במערכת העצבים המרכזית.
בפרוטוקול זה מתוארים הליכי ההתקנה הבסיסיים של מיקרוסקופ TPEF-SRS ביתי ומוכנסים המודאליות הכפולות בשיטות הדמיית vivo לחוט השדרה של העכבר.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, ההתקנה הבסיסית של מיקרוסקופ TPEF-SRS מתוארת בפירוט. עבור הדמיית SRS, המשאבה וקורות סטוקס חופפות זמנית ומרחבית בתוך OPO. עם זאת, חפיפה זו יכולה להיות משובשת לאחר שעבר דרך מערכת המיקרוסקופ. לכן, הן אופטימיזציה מרחבית והן אופטימיזציה זמנית של colocalization של המשאבה וקורות סטוקס הוא הכרחי ו?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מועצת מענקי המחקר של הונג קונג באמצעות מענקים 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, ועדת החדשנות והטכנולוגיה (ITCPD/17-9), תחום תוכנית המצוינות של ועדת המענקים של האוניברסיטה (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12), ואוניברסיטת הונג קונג למדע וטכנולוגיה (HKUST) באמצעות מענק RPC10EG33.
Materials
| #2 Forceps | Dumont | 11223-20 | For laminectomy |
| 10X objective | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 10X | |
| 25X objective | Olympus | XLPLN25XSVMP2 | |
| Burn cream | Betadine | ||
| Camera | Sony | α6300 | |
| Current amplifier | Stanford research | SR570 | |
| Current photomultiplier modules | Hamamatsu | H11461-01 | |
| D2 665 nm long-pass dichroic mirror | Semrock | FF665-Di02-25×36 | For directing epi-fluorescence signal to the detection module |
| D3 700 nm short-pass dichroic mirror | Edmund | 69-206 | For separating SRS from TPEF detection path |
| Depilating cream | Veet | ||
| FS1 975 nm short-pass filter | Edmund | 86-108 | For blocking stokes beam |
| FS1 Bandpass filter | Semrock | FF01-850/310 | For blocking stokes beam |
| Fs2 Bandpass filter | Semrock | FF01-525/50 | For selecting YFP signal |
| Fs2 Shortpass filter | Semrock | FF01-715/SP-25 | For blocking fs excitation laser beam |
| Half-wave plate | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | |
| High-speed photodetector | MenloSystems | FPD 310-F | For checking Stokes beam modulation |
| Iodine | Betadine | ||
| IR Scope | FJW | FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X | |
| Iris | Thorlabs | CPA1 | |
| L1 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L10 | Thorlabs | LA4052-A | |
| L2 | Thorlabs | LA1422-B | |
| L3 | Thorlabs | AC254-050-B | |
| L4 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L7 | f=100 mm, AB coating | ||
| L8 | Thorlabs | LA4874-A | |
| L9 | Thorlabs | AC254-035-B-ML | |
| Lock-in amplifier | APE | ||
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | |
| Motorized flipper | Thorlabs | MFF101/M | |
| multifunctional acquisition card | National Instrument | PCIe-6363 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2012C | |
| Photodiode | APE | For detecting SRS signal | |
| Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
| Polarizing beam splitter | Thorlabs | CCM1-PBS252/M | |
| Power meter | Newport | 843-R | |
| Saline | Braun | ||
| Scan lens L5 | Thorlabs | SL50-CLS2 | |
| Scanning mirror | Cambridge Technology | 6215H | |
| Silicone gel | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
| Ti:sapphire fs laser | Coherent | Chameleon Ultra II | |
| Tube lens L6 | Thorlabs | TTL200-S8 |
Riferimenti
- Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711 (1928).
- Turrell, G., Corset, J. . Raman Microscopy: Developments and Applications. , (1996).
- Tian, F., et al. Monitoring peripheral nerve degeneration in ALS by label-free stimulated Raman scattering imaging. Nature Communications. 7 (1), 13283 (2016).
- Shi, Y., et al. Longitudinal in vivo coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of demyelination and remyelination in injured spinal cord. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106012 (2011).
- Hu, C. R., Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -. X., Hu, B. Label-free real-time imaging of myelination in the Xenopus laevis tadpole by in vivo Stimulated Raman Scattering Microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (8), 086005 (2014).
- Den Broeder, M. J., et al. Altered adipogenesis in Zebrafish larvae following high fat diet and chemical exposure is visualised by Stimulated Raman Scattering Microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 894 (2017).
- He, S., et al. In vivo metabolic imaging and monitoring of brown and beige fat. Journal of Biophotonics. 11 (8), (2018).
- Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
- Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
- Zhang, C., Li, J., Lan, L., Cheng, J. -. X. Quantification of lipid metabolism in living cells through the dynamics of lipid droplets measured by Stimulated Raman Scattering Imaging. Analytical Chemistry. 89 (8), 4502-4507 (2017).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. Journal of the American Chemical Society. 139 (47), 17022-17030 (2017).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Pawlicki, M., Collins, H. A., Denning, R. G., Anderson, H. L. Two-photon absorption and the design of two-photon dyes. Angewandte Chemie International Edition. 48 (18), 3244-3266 (2009).
- König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200 (2), 83-104 (2000).
- Dean, K. M., Palmer, A. E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nature Chemical Biology. 10 (7), 512-523 (2014).
- Tsurui, H., et al. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
- Niehörster, T., et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature Methods. 13 (3), 257-262 (2016).
- Zhang, X., et al. Label-free live cell imaging of nucleic acids using Stimulated Raman Scattering (SRS) Microscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer’s disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 7715 (2018).
- Li, X., et al. Integrated femtosecond stimulated Raman scattering and two-photon fluorescence imaging of subcellular lipid and vesicular structures. Journal of Biomedical Optics. 20 (11), 110501 (2015).
- Imitola, J., et al. Multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy reveals microglia-associated myelin and axonal dysfunction in multiple sclerosis-like lesions in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 021109 (2011).
- Uckermann, O., et al. Label-free multiphoton microscopy reveals altered tissue architecture in hippocampal sclerosis. Epilepsia. 58 (1), 1-5 (2017).
- Tamosaityte, S., et al. Inflammation-related alterations of lipids after spinal cord injury revealed by Raman spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), 061008 (2016).
- Uckermann, O., et al. Endogenous two-photon excited fluorescence provides label-free visualization of the inflammatory response in the rodent spinal cord. BioMed Research International. 2015, 859084 (2015).
- van Hameren, G., et al. In vivo real-time dynamics of ATP and ROS production in axonal mitochondria show decoupling in mouse models of peripheral neuropathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 1-16 (2019).
- Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3 (1), 1-15 (2012).
- Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
- Lau, S. -. F., et al. IL-33-PU.1 transcriptome reprogramming drives functional state transition and clearance activity of microglia in Alzheimer’s Disease. Cell Reports. 31 (3), 107530 (2020).
- Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Scientific Reports. 5, 9691 (2015).
- Yang, Z., Xie, W., Ju, F., Khan, A., Zhang, S. In vivo two-photon imaging reveals a role of progesterone in reducing axonal dieback after spinal cord injury in mice. Neuropharmacology. 116, 30-37 (2017).
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis – a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. Journal of Comparative Neurology. 486 (4), 373-383 (2005).
- Kopper, T. J., Gensel, J. C. Myelin as an inflammatory mediator: Myelin interactions with complement, macrophages, and microglia in spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (6), 969-977 (2018).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Pedrotti, F. L., Pedrotti, L. M., Pedrotti, L. S. . Introduction to Optics. , (2017).
- Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), 37-61 (2013).
- Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -. X. Highly sensitive vibrational imaging by Femtosecond Pulse Stimulated Raman Loss. The Journal of Physical Chemistry Letters. 2 (11), 1248-1253 (2011).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
- Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging. Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an Alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
- van Manen, H. -. J., Lenferink, A., Otto, C. Noninvasive imaging of protein metabolic labeling in single human cells using stable isotopes and Raman Microscopy. Analytical Chemistry. 80 (24), 9576-9582 (2008).
- Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
- Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
- Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-21 (2017).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).
