En etiketfri segmenteringsmetode til intravital billeddannelse af brysttumormikromiljø

Summary

Den intravitale billeddannelsesmetode, der er beskrevet her, anvender kollagen anden harmonisk generation og endogen fluorescens fra den metaboliske co-faktor NAD (P) H til ikke-invasivt at segmentere et umærket tumormikromiljø i tumor-, stromal- og vaskulære rum til dybdegående analyse af 4D-intravitale billeder.

Abstract

Evnen til at visualisere komplekse og dynamiske fysiologiske interaktioner mellem adskillige celletyper og den ekstracellulære matrix (ECM) inden for et levende tumormikromiljø er et vigtigt skridt i retning af at forstå mekanismer, der regulerer tumorprogression. Selvom dette kan opnås gennem nuværende intravitale billeddannelsesteknikker, er det stadig udfordrende på grund af vævets heterogene karakter og behovet for rumlig kontekst inden for den eksperimentelle observation. Til dette formål har vi udviklet en intravital billeddannelsesarbejdsgang, der parrer kollagen anden harmonisk generationsbilleddannelse, endogen fluorescens fra den metaboliske co-faktor NAD (P) H og fluorescens levetidsbilleddannelsesmikroskopi (FLIM) som et middel til ikke-invasivt at opdele tumormikromiljøet i grundlæggende domæner af tumorreden, den omgivende stroma eller ECM og vaskulaturen. Denne ikke-invasive protokol beskriver den trinvise proces, der spænder fra erhvervelse af time-lapse-billeder af brysttumormodeller til efterbehandlingsanalyse og billedsegmentering. Den primære fordel ved denne arbejdsgang er, at den udnytter metaboliske signaturer til at kontekstualisere det dynamisk skiftende levende tumormikromiljø uden brug af eksogene fluorescerende etiketter, hvilket gør det fordelagtigt for humane patientafledte xenograft (PDX) modeller og fremtidig klinisk brug, hvor ydre fluoroforer ikke er let anvendelige.

Introduction

Den ekstracellulære matrix (ECM) i tumormikromiljøet er kendt for at være dynamisk deponeret og ombygget af flere celletyper for yderligere at lette sygdomsprogression ^1,2,3. Disse matrixændringer giver både mekaniske og biologiske signaler, der ændrer celleadfærd og ofte resulterer i en fortsat cyklus af matrixombygning⁴. Undersøgelse af det dynamiske, gensidige samspil mellem tumorceller og den ekstracellulære matrix udføres ofte ved hjælp af tredimensionel (3D) in vitro-kultur eller mikrofluidiske systemer. Mens disse bottom-up-tilgange har vist mekanismer til ECM-ombygning ^5,6,7, øget proliferation⁸, epitel til mesenkym overgang ^9,10,11,12 og tumorcellemigration og invasion ^{7,13,14,15,16} , har deres fokus primært været på nogle få celletyper (f.eks. Tumorceller eller fibroblaster) inden for en homogen 3D-matrix sammenlignet med mangfoldigheden og heterogeniteten af interaktioner, der er til stede i et fysiologisk væv. Ud over in vitro-systemer kan ex vivo tumor histologi også give en vis indsigt i disse celle-celle og celle-ECM-interaktioner¹⁷. Immunohistokemi har den fordel, at den er i stand til at analysere flere celletyper med hensyn til ECM’s rumligt heterogene sammensætning og arkitektur, men de statiske endepunkter for fast væv fanger ikke den dynamiske karakter af interaktioner mellem celler og mikromiljøet. Intravital billeddannelse har åbnet døren for at forhøre forskellige og dynamiske interaktioner inden for den fysiologiske kontekst af det oprindelige tumormikromiljø.

Mulighederne for intravital tumorbilleddannelse skrider hurtigt frem. Forbedringer i designet af billeddannelsesvinduer og kirurgiske teknikker til implantering af vinduerne har muliggjort langsigtet langsgående tumorbilleddannelse på en række anatomiske steder (dvs. primær tumor, lymfeknuder, metastatiske steder 18,19,20). Desuden bliver optisk instrumenterings kapacitet til at visualisere og indsamle data i flere dimensioner (dvs. spektral, rumlig fluorescensintensitet og levetid) og ved høj opløsning og hastighed (videohastighed) bredt tilgængelig. Den forbedrede teknologi giver mulighed for at udforske hurtige ændringer i cellesignalering og fænotypisk dynamik inden for et fysiologisk miljø. Endelig giver udvidelsen af optogenetiske værktøjer og den brede vifte af genetiske fluorescerende konstruktioner mulighed for mærkning af specifikke celletyper for at fange cellemigration i tumormikromiljø- eller celleafstamningssporing under udvikling eller sygdomsprogression^21,22. Brugen af disse værktøjer i kombination med CRISPR/Cas9-teknologien giver forskerne mulighed for at generere unikke dyremodeller i tide.

Mens alle disse fremskridt gør intravital billeddannelse til en stadig mere kraftfuld metode til at udforske dynamiske og fysiologiske cellulære interaktioner, er der stadig et vigtigt behov for at udvikle strategier, der giver rumlig, tidsmæssig og strukturel kontekst på vævsniveau til disse biologiske interaktioner. I øjeblikket kompenserer mange intravitale billeddannelsesundersøgelser for manglen på visuelle landemærker såsom blodkar ved at injicere fluorescerende farvestoffer i vaskulaturen eller anvende musemodeller, der eksogent udtrykker fluorescerende proteiner for at afgrænse fysiske træk. Injicerbare farvestoffer og substrater som fluorescerende dextrans anvendes bredt til med succes at mærke vaskulaturen i intravitale samlinger^{19, 23, 24}. Denne tilgang er imidlertid ikke uden begrænsninger. For det første kræver det yderligere musemanipulationer, og dets anvendelighed er begrænset til kortsigtede eksperimenter. Til langsgående undersøgelser kan fluorescerende dextran være problematisk, da vi observerer akkumuleringen af dextran i fagocytiske celler eller diffusion i det omgivende væv over tid²⁵. Eksogen fluorescerende proteininkorporering i musemodellen er blevet præsenteret som et alternativ til fluorescerende dextrans, men præsenterer sine egne begrænsninger. Tilgængeligheden og mangfoldigheden af eksogene fluoroforer i musemodeller er stadig begrænset og dyr at skabe. Derudover er genetiske manipulationer i specifikke modeller, såsom PDX-modeller, ikke ønskelige eller mulige. Det har også vist sig, at tilstedeværelsen af fluorescerende eller bioluminescerende proteiner i celler anerkendes som fremmede i musen, og inden for immunkompetente musemodeller reducerer dette mængden af metastase på grund af værtsimmunsystemets respons^26,27. Endelig optager eksogene fluorescerende proteiner eller fluorescerende farvestoffer, der anvendes til rumlig kontekst eller til at segmentere efterfølgende data, ofte primære områder af lysspektret, der ellers kunne bruges til at undersøge de fysiologiske interaktioner af interesse.

Anvendelsen af det indre signal fra ECM eller endogen fluorescens fra celler i vævet repræsenterer et potentielt universelt etiketfrit middel til at segmentere intravitale data til mere dybtgående cellulær og rumlig analyse. Anden harmoniske generation (SHG) har længe været brugt til at visualisere ECM²⁸. Med den efterfølgende udvikling af vigtige værktøjer til at hjælpe med karakteriseringen af fiberorganisation 29,30,31 er det muligt at karakterisere celleadfærd i forhold til lokal ECM-struktur. Derudover giver autofluorescens fra den endogene metabolit, NAD (P) H, et andet etiketfrit værktøj til at opdele tumormikromiljøet in vivo. NAD(P)H fluorescerer kraftigt i tumorceller og kan bruges til at skelne grænserne for den voksende tumorrede fra den omgivende stroma^21,32. Endelig er vaskulaturen en vigtig fysiologisk struktur i tumormikromiljøet og stedet for nøglecelletypespecifikke interaktioner 33,34,35. Excitationen af røde blodlegemer (RBC) eller blodplasma er blevet brugt til at visualisere tumorvaskulaturen, og ved hjælp af to- eller tre-foton-excitation (2P; 3P) har målingen af blodgennemstrømningshastigheder vist sig at være mulig³⁶. Men mens større blodkar let kan identificeres ved deres endogene fluorescenssignaturer, kræver identifikationen af subtile, variable og mindre fluorescerende små blodkar mere ekspertise. Disse iboende vanskeligheder hindrer optimal billedsegmentering. Heldigvis kan disse kilder til endogen fluorescens (dvs. røde blodlegemer og blodplasma) også måles ved fluorescens^{levetidsbilleddannelse 37}, som udnytter vaskulaturens unikke fotofysiske egenskaber og repræsenterer en nyttig tilføjelse til den voksende intravitale værktøjskasse.

I denne protokol beskrives en arbejdsgang til segmentering af firedimensionel (4D) intravital billeddannelse eksplicit ved hjælp af iboende signaler som endogen fluorescens og SHG fra erhvervelse til analyse. Denne protokol er især relevant for langsgående undersøgelser gennem et brystbilleddannelsesvindue, hvor eksogen fluorescens muligvis ikke er praktisk eller mulig, som det er tilfældet med PDX-modeller. De segmenteringsprincipper, der er skitseret her, er imidlertid bredt anvendelige for intravitale brugere, der undersøger tumorbiologi, vævsudvikling eller endda normal vævsfysiologi. Den rapporterede pakke af analysemetoder vil give brugerne mulighed for at differentiere cellulær adfærd mellem regioner med justerede eller tilfældige kollagenfiberkonfigurationer, sammenligne tal eller adfærd af celler, der er bosiddende i bestemte regioner i tumormikromiljøet, og kortlægge vaskulaturen til tumormikromiljøet ved kun at bruge etiketfrit eller iboende signal. Sammen skaber disse metoder en operationel ramme for at maksimere dybden af information opnået ved 4D intravital billeddannelse af brystkirtlen, samtidig med at behovet for yderligere eksogene etiketter minimeres.

Protocol

Alle beskrevne eksperimenter blev godkendt af University of Wisconsin-Madisons Institutional Animal Care and Use Committee. Trivsel og smertebehandling i alle dyreforsøg er altafgørende. Således gøres alt for at sikre, at dyret er behageligt og velplejet på hvert trin i proceduren. 1. Generering af brystbilleddannelsesvinduet (MIW) For at konstruere brystbilleddannelsesvinduet skal du fremstille en 14 mm ring af rustfrit stål af kirurgisk kvalitet. Re…

Representative Results

Installationen af MIW og grundlæggende eksperimentel planlægning er de første skridt i denne proces. Dette særlige MIW-design og -protokol er mere modtagelige for langsgående undersøgelser19 og er blevet brugt med succes med både opretstående og omvendte mikroskoper. I dette tilfælde blev der anvendt et omvendt mikroskop, da det har resulteret i større billedstabilitet i brystkirtlen med færre vejrtrækningsartefakter. I figur 1A giver vi dimensionerne af d…

Discussion

4D intravital billeddannelse er et kraftfuldt værktøj til at undersøge dynamiske fysiologiske interaktioner inden for den rumlige og tidsmæssige kontekst af det oprindelige tumormikromiljø. Dette manuskript giver en meget grundlæggende og tilpasningsdygtig operationel ramme til opdeling af dynamiske celleinteraktioner inden for tumormassen, den tilstødende stroma eller i nærheden af det vaskulære netværk ved kun at bruge endogene signaler fra anden harmonisk generation eller NAD (P) H autofluorescens. Denne pro…

Materials

#1.5 12mm round cover glass	Warner Instruments	# 64-0712	MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection	BD	309659	Syringe
20x objective	Zeiss	421452-988	Water immersion
27G needle for SQ injection	Covidien	1188827012	Needle
40x objective	Nikon	MRD77410	Water immersion
5-0 silk braided suture	Ethicon	K870	Suture for MIW implantation
Artificial tears gel	Akorn	NDC 59399-162-35	Eye gel
Betadine solution, 5%	Fisher Scientific	NC1558063	Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-101
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882	MIW construction
fluorescent dextran	Sigma	T1287-50mg	intravenous labelling of vasculature
forceps	Mckesson.com	Miltex #18-782	stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube	Hamamatsu
heating blanket	CARA 72 heating pad	038056000729	Temperature selectable
heating chamber	home built
Fluorescent lifetime handbook	Becker and Hickl		https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base	Nikon
Isoflurane	Akorn	NDC 59399-106-01	Anesthesia
Liqui-Nox	Fisher Scientific	16-000-125	MIW cleaning
Meloxicam	Norbrook	NDC 55529-040-10	Analgesic
Micro Hose	Scientific Commodities INC.	BB31695-PE/1
multiphoton scan head	Bruker Ultima II		Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter	Chroma	284994	ET 440/80 m-2P
Nair	CVS	339826	Depilatory cream
objective heater	Tokai Hit	STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter	Chroma	320740	ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner	Amazon.com	B00814ME24	Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board	Becker and Hickl
surgical light	FAJ	B06XV1VQVZ	Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors	Excelta	366	stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment	Actavis Pharma	NDC 0472-0179-34	Antibiotic
TV catheter	Custom	BD 30G needle: 305106	Catheter for TV injection
Two photon filter	Chroma	320282	ET585/65m-2P
two-photon laser	Coherent charmeleon		Tunable multiphoton laser
ultrasound gel	Parker	PKR-03-02	Water immersion gel
Urea crystals	Sigma	U5128-5G	Optional: FLIM IRF