Un approccio di segmentazione senza etichette per l'imaging intravitale del microambiente del tumore mammario

Summary

Il metodo di imaging intravitale qui descritto utilizza la seconda generazione armonica di collagene e la fluorescenza endogena dal cofattore metabolico NAD(P)H per segmentare in modo non invasivo un microambiente tumorale non etichettato in compartimenti tumorali, stromali e vascolari per l’analisi approfondita delle immagini intravitali 4D.

Abstract

La capacità di visualizzare interazioni fisiologiche complesse e dinamiche tra numerosi tipi di cellule e la matrice extracellulare (ECM) all’interno di un microambiente tumorale vivo è un passo importante verso la comprensione dei meccanismi che regolano la progressione del tumore. Mentre questo può essere realizzato attraverso le attuali tecniche di imaging intravitale, rimane impegnativo a causa della natura eterogenea dei tessuti e della necessità di un contesto spaziale all’interno dell’osservazione sperimentale. A tal fine, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro di imaging intravitale che accoppia l’imaging di seconda generazione armonica del collagene, la fluorescenza endogena dal cofattore metabolico NAD(P)H e la microscopia di imaging a vita di fluorescenza (FLIM) come mezzo per compartimentare in modo non invasivo il microambiente tumorale in domini di base del nido tumorale, dello stroma circostante o ECM e della vascolarizzazione. Questo protocollo non invasivo descrive in dettaglio il processo passo-passo che va dall’acquisizione di immagini time-lapse di modelli di tumore mammario all’analisi post-elaborazione e alla segmentazione delle immagini. Il vantaggio principale di questo flusso di lavoro è che sfrutta le firme metaboliche per contestualizzare il microambiente tumorale vivo che cambia dinamicamente senza l’uso di etichette fluorescenti esogene, rendendolo vantaggioso per i modelli di xenotrapianti derivati dal paziente umano (PDX) e per il futuro uso clinico in cui i fluorofori estrinseci non sono facilmente applicabili.

Introduction

La matrice extracellulare (ECM) nel microambiente tumorale è nota per essere depositata dinamicamente e rimodellata da più tipi di cellule per facilitare ulteriormente la progressione della malattia ^1,2,3. Queste alterazioni della matrice forniscono segnali sia meccanici che biologici che alterano il comportamento cellulare e spesso si traducono in un ciclo continuo di rimodellamento della matrice⁴. L’indagine sull’interazione dinamica e reciproca tra le cellule tumorali e la matrice extracellulare viene spesso condotta utilizzando colture tridimensionali (3D) in vitro o sistemi microfluidici. Mentre questi approcci bottom-up hanno dimostrato meccanismi di rimodellamento dell’ECM ^5,6,7, aumento della proliferazione⁸, transizione da epiteliale a mesenchimale ^9,10,11,12 e migrazione e invasione delle cellule tumorali ^{7,13,14,15,16} , il loro focus si è concentrato principalmente su alcuni tipi di cellule (ad esempio, cellule tumorali o fibroblasti) all’interno di una matrice 3D omogenea rispetto alla diversità e all’eterogeneità delle interazioni presenti all’interno di un tessuto fisiologico. Oltre ai sistemi in vitro, l’istologia tumorale ex vivo può anche fornire alcune informazioni su queste interazioni cellula-cellula e cellula-ECM¹⁷. L’immunoistochimica ha il vantaggio di poter analizzare più tipi di cellule rispetto alla composizione e all’architettura spazialmente eterogenee dell’ECM, ma gli endpoint statici del tessuto fisso non catturano la natura dinamica delle interazioni tra le cellule e il microambiente. L’imaging intravitale ha aperto la porta per interrogare interazioni diverse e dinamiche all’interno del contesto fisiologico del microambiente tumorale nativo.

Le capacità dell’imaging tumorale intravitale stanno rapidamente avanzando. I miglioramenti nella progettazione delle finestre di imaging e le tecniche chirurgiche per impiantare le finestre hanno consentito l’imaging longitudinale del tumore a lungo termine in una varietà di posizioni anatomiche (ad esempio, tumore primario, linfonodi, siti metastatici 18,19,20). Inoltre, la capacità della strumentazione ottica di visualizzare e raccogliere dati in più dimensioni (ad esempio, spettrale, intensità di fluorescenza spaziale e durata) e ad alta risoluzione e velocità (velocità video) sta diventando ampiamente accessibile. La tecnologia migliorata offre l’opportunità di esplorare rapidi cambiamenti nella segnalazione cellulare e nelle dinamiche fenotipiche all’interno di un ambiente fisiologico. Infine, l’espansione degli strumenti optogenetici e l’ampia gamma di costrutti fluorescenti genetici consentono l’etichettatura di specifici tipi di cellule per catturare la migrazione cellulare nel microambiente tumorale o il tracciamento del lignaggio cellulare durante lo sviluppo o la progressione della malattia^21,22. L’uso di questi strumenti in combinazione con la tecnologia CRISPR / Cas9 offre ai ricercatori l’opportunità di generare modelli animali unici in modo tempestivo.

Mentre tutti questi progressi rendono l’imaging intravitale un metodo sempre più potente per esplorare le interazioni cellulari dinamiche e fisiologiche, c’è ancora un’importante necessità di sviluppare strategie che forniscano un contesto spaziale, temporale e strutturale a livello tissutale a queste interazioni biologiche. Attualmente, molti studi di imaging intravitale compensano la mancanza di punti di riferimento visivi come i vasi sanguigni iniettando coloranti fluorescenti nella vascolarizzazione o impiegando modelli murini che esprimono esogenamente proteine fluorescenti per delineare le caratteristiche fisiche. Coloranti iniettabili e substrati come dextrans fluorescenti sono ampiamente utilizzati per etichettare con successo la vascolarizzazione nelle collezioni intravitali^{19, 23, 24}. Tuttavia, questo approccio non è privo di limitazioni. Per uno, richiede ulteriori manipolazioni del mouse e la sua utilità è limitata agli esperimenti a breve termine. Per gli studi longitudinali, il destrano fluorescente può essere problematico in quanto osserviamo l’accumulo di destrano nelle cellule fagocitiche o la diffusione nel tessuto circostante nel tempo²⁵. L’incorporazione di proteine fluorescenti esogene nel modello murino è stata presentata come alternativa al dextrans fluorescente, ma presenta dei limiti propri. La disponibilità e la diversità dei fluorofori esogeni all’interno dei modelli murini sono ancora limitate e costose da creare. Inoltre, in modelli specifici, come i modelli PDX, le manipolazioni genetiche non sono desiderabili o possibili. È stato anche dimostrato che la presenza di proteine fluorescenti o bioluminescenti all’interno delle cellule sono riconosciute come estranee all’interno del topo, e all’interno di modelli murini immunocompetenti, questo riduce la quantità di metastasi dovute alla risposta del sistema immunitario dell’ospite^26,27. Infine, le proteine fluorescenti esogene o i coloranti fluorescenti utilizzati per il contesto spaziale o per segmentare i dati successivi spesso occupano intervalli primi dello spettro luminoso che potrebbero altrimenti essere utilizzati per indagare le interazioni fisiologiche di interesse.

L’uso del segnale intrinseco dall’ECM o della fluorescenza endogena dalle cellule all’interno del tessuto rappresenta un potenziale mezzo universale privo di etichette per segmentare i dati intravitali per un’analisi cellulare e spaziale più approfondita. La seconda generazione armonica (SHG) è stata a lungo utilizzata per visualizzare l’ECM²⁸. Con il successivo sviluppo di importanti strumenti per aiutare nella caratterizzazione dell’organizzazione delle fibre 29,30,31, è possibile caratterizzare il comportamento cellulare relativo alla struttura ECM locale. Inoltre, l’autofluorescenza del metabolita endogeno, NAD(P)H, fornisce un altro strumento privo di etichette per compartimentare il microambiente tumorale in vivo. Nad(P)H fluoresce brillantemente nelle cellule tumorali e può essere utilizzato per discriminare i confini del nido tumorale in crescita dal suo stroma circostante^21,32. Infine, la vascolarizzazione è un’importante struttura fisiologica nel microambiente tumorale e il sito di interazioni chiave specifiche per tipo cellulare 33,34,35. L’eccitazione dei globuli rossi (RBC) o del plasma sanguigno è stata utilizzata per visualizzare la vascolarizzazione tumorale e utilizzando l’eccitazione a due o tre fotoni (2P; 3P) la misurazione delle velocità del flusso sanguigno ha dimostrato di essere possibile³⁶. Tuttavia, mentre i vasi sanguigni più grandi sono facilmente identificabili dalle loro firme di fluorescenza endogena, l’identificazione di piccoli vasi sanguigni sottili, variabili e meno fluorescenti richiede più esperienza. Queste difficoltà intrinseche ostacolano la segmentazione ottimale dell’immagine. Fortunatamente, queste fonti di fluorescenza endogena (cioè globuli rossi e plasma sanguigno) possono anche essere misurate mediante imaging a fluorescenza^{a vita 37}, che capitalizza sulle proprietà fotofisiche uniche della vascolarizzazione e rappresenta un’utile aggiunta alla crescente cassetta degli attrezzi intravitale.

In questo protocollo, viene descritto un flusso di lavoro per la segmentazione dell’imaging intravitale quadridimensionale (4D) utilizzando esplicitamente segnali intrinseci come la fluorescenza endogena e l’SHG dall’acquisizione all’analisi. Questo protocollo è particolarmente pertinente per gli studi longitudinali attraverso una finestra di imaging mammario in cui la fluorescenza esogena potrebbe non essere pratica o possibile, come nel caso dei modelli PDX. I principi di segmentazione qui delineati, tuttavia, sono ampiamente applicabili agli utenti intravitali che studiano la biologia del tumore, lo sviluppo dei tessuti o anche la normale fisiologia dei tessuti. La suite di approcci di analisi riportata consentirà agli utenti di differenziare il comportamento cellulare tra regioni di configurazioni di fibre di collagene allineate o casuali, confrontare numeri o comportamenti di cellule residenti in regioni specifiche del microambiente tumorale e mappare la vascolarizzazione al microambiente tumorale utilizzando solo il segnale privo di etichette o intrinseco. Insieme, questi metodi creano un quadro operativo per massimizzare la profondità delle informazioni acquisite dall’imaging intravitale 4D della ghiandola mammaria, riducendo al minimo la necessità di ulteriori etichette esogene.

Protocol

Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali dell’Università del Wisconsin-Madison. Il benessere e la gestione del dolore in tutti gli esperimenti sugli animali sono fondamentali. Pertanto, viene fatto ogni sforzo per assicurarsi che l’animale sia a suo agio e ben curato in ogni fase della procedura. 1. Generazione della finestra di imaging mammario (MIW) Per costruire la finestra di imaging mammar…

Representative Results

L’installazione del MIW e la pianificazione sperimentale di base sono i primi passi in questo processo. Questo particolare design e protocollo MIW è più suscettibile agli studi longitudinali19 ed è stato utilizzato con successo sia con microscopi verticali che invertiti. In questo caso, è stato utilizzato un microscopio invertito in quanto ha portato a una maggiore stabilità dell’immagine della ghiandola mammaria con meno artefatti respiratori. Nella Figura 1A, f…

Discussion

L’imaging intravitale 4D è un potente strumento per studiare le interazioni fisiologiche dinamiche all’interno del contesto spaziale e temporale del microambiente tumorale nativo. Questo manoscritto fornisce un quadro operativo molto semplice e adattabile per compartimentare le interazioni cellulari dinamiche all’interno della massa tumorale, dello stroma adiacente o in prossimità della rete vascolare utilizzando solo segnali endogeni dalla seconda generazione armonica o dall’autofluorescenza NAD(P)H. Questo protocollo…

Materials

#1.5 12mm round cover glass	Warner Instruments	# 64-0712	MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection	BD	309659	Syringe
20x objective	Zeiss	421452-988	Water immersion
27G needle for SQ injection	Covidien	1188827012	Needle
40x objective	Nikon	MRD77410	Water immersion
5-0 silk braided suture	Ethicon	K870	Suture for MIW implantation
Artificial tears gel	Akorn	NDC 59399-162-35	Eye gel
Betadine solution, 5%	Fisher Scientific	NC1558063	Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-101
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882	MIW construction
fluorescent dextran	Sigma	T1287-50mg	intravenous labelling of vasculature
forceps	Mckesson.com	Miltex #18-782	stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube	Hamamatsu
heating blanket	CARA 72 heating pad	038056000729	Temperature selectable
heating chamber	home built
Fluorescent lifetime handbook	Becker and Hickl		https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base	Nikon
Isoflurane	Akorn	NDC 59399-106-01	Anesthesia
Liqui-Nox	Fisher Scientific	16-000-125	MIW cleaning
Meloxicam	Norbrook	NDC 55529-040-10	Analgesic
Micro Hose	Scientific Commodities INC.	BB31695-PE/1
multiphoton scan head	Bruker Ultima II		Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter	Chroma	284994	ET 440/80 m-2P
Nair	CVS	339826	Depilatory cream
objective heater	Tokai Hit	STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter	Chroma	320740	ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner	Amazon.com	B00814ME24	Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board	Becker and Hickl
surgical light	FAJ	B06XV1VQVZ	Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors	Excelta	366	stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment	Actavis Pharma	NDC 0472-0179-34	Antibiotic
TV catheter	Custom	BD 30G needle: 305106	Catheter for TV injection
Two photon filter	Chroma	320282	ET585/65m-2P
two-photon laser	Coherent charmeleon		Tunable multiphoton laser
ultrasound gel	Parker	PKR-03-02	Water immersion gel
Urea crystals	Sigma	U5128-5G	Optional: FLIM IRF