Den intravitale avbildningsmetoden som er beskrevet her, bruker kollagen andre harmoniske generasjon og endogen fluorescens fra den metabolske kofaktoren NAD (P)H til ikke-invasivt segmentere et umerket tumormikromiljø i tumor-, stromal- og vaskulære rom for grundig analyse av 4D intravitale bilder.
Evnen til å visualisere komplekse og dynamiske fysiologiske interaksjoner mellom mange celletyper og den ekstracellulære matrisen (ECM) i et levende tumormikromiljø er et viktig skritt mot å forstå mekanismer som regulerer tumorprogresjon. Selv om dette kan oppnås gjennom dagens intravitale avbildningsteknikker, er det fortsatt utfordrende på grunn av vevets heterogene natur og behovet for romlig kontekst innenfor den eksperimentelle observasjonen. For dette formål har vi utviklet en intravital bildearbeidsflyt som kombinerer kollagen andre harmoniske generasjonsavbildning, endogen fluorescens fra den metabolske kofaktoren NAD (P)H, og fluorescens levetidsavbildningsmikroskopi (FLIM) som et middel til ikke-invasivt å dele opp tumormikromiljøet i grunnleggende domener av tumorreiret, den omkringliggende stroma eller ECM, og vaskulaturen. Denne ikke-invasive protokollen beskriver den trinnvise prosessen som spenner fra oppkjøp av tidsforløpbilder av mammary tumormodeller til etterbehandlingsanalyse og bildesegmentering. Den viktigste fordelen med denne arbeidsflyten er at den utnytter metabolske signaturer for å kontekstualisere det dynamisk skiftende levende tumormikromiljøet uten bruk av eksogene fluorescerende etiketter, noe som gjør det fordelaktig for humane pasientavledede xenograft (PDX) modeller og fremtidig klinisk bruk der ekstrinsiske fluoroforer ikke er lett anvendelige.
Den ekstracellulære matrisen (ECM) i tumormikromiljøet er kjent for å bli dynamisk avsatt og ombygd av flere celletyper for ytterligere å lette sykdomsprogresjonen 1,2,3. Disse matriseendringene gir både mekaniske og biologiske signaler som endrer celleadferd og ofte resulterer i en kontinuerlig syklus av matriseoppussing4. Undersøkelse av det dynamiske, gjensidige samspillet mellom tumorceller og den ekstracellulære matrisen utføres ofte ved hjelp av tredimensjonal (3D) in vitrokultur eller mikrofluidiske systemer. Mens disse nedenfra-og-opp-tilnærmingene har demonstrert mekanismer for ECM-ombygging 5,6,7, økt spredning8, epitelial til mesenchymal overgang 9,10,11,12, og tumorcellemigrasjon og invasjon 7,13,14,15,16 , har deres fokus primært vært på noen få celletyper (f.eks. tumorceller eller fibroblaster) innenfor en homogen 3D-matrise sammenlignet med mangfoldet og heterogeniteten til interaksjoner som finnes i et fysiologisk vev. I tillegg til in vitro-systemer kan ex vivo tumor histologi også gi litt innsikt i disse cellecelle- og celle-ECM-interaksjonene17. Immunohistokjemi har fordelen av å kunne analysere flere celletyper med hensyn til den romlig heterogene sammensetningen og arkitekturen til ECM, men de statiske endepunktene i fast vev fanger ikke opp den dynamiske naturen til interaksjoner mellom celler og mikromiljøet. Intravital avbildning har åpnet døren for å forhøre ulike og dynamiske interaksjoner innenfor den fysiologiske konteksten til det opprinnelige tumormikromiljøet.
Evnen til intravital tumoravbildning utvikler seg raskt. Forbedringer i utformingen av bildevinduer og kirurgiske teknikker for å implantere vinduene har gjort det mulig med langvarig langsgående tumoravbildning på en rekke anatomiske steder (dvs. primærsvulst, lymfeknuter, metastatiske steder 18,19,20). Dessuten blir kapasiteten til optisk instrumentering til å visualisere og samle inn data i flere dimensjoner (dvs. spektral, romlig fluorescensintensitet og levetid), og med høy oppløsning og hastighet (videohastighet) allment tilgjengelig. Den forbedrede teknologien gir en mulighet til å utforske raske endringer i cellesignalering og fenotypisk dynamikk i et fysiologisk miljø. Til slutt tillater utvidelsen av optogenetiske verktøy og det brede spekteret av genetiske fluorescerende konstruksjoner tagging av spesifikke celletyper for å fange cellemigrasjon i tumormikromiljøet eller cellelinjesporing under utvikling eller sykdomsprogresjon 21,22. Bruken av disse verktøyene i kombinasjon med CRISPR/Cas9-teknologi gir forskerne mulighet til å generere unike dyremodeller i tide.
Mens alle disse fremskrittene gjør intravital avbildning til en stadig kraftigere metode for å utforske dynamiske og fysiologiske cellulære interaksjoner, er det fortsatt et viktig behov for å utvikle strategier som gir romlig, tidsmessig og strukturell kontekst på vevsnivå til disse biologiske interaksjonene. For tiden kompenserer mange intravitale avbildningsstudier for mangel på visuelle landemerker som blodkar ved å injisere fluorescerende fargestoffer i vaskulaturen eller bruke musemodeller som eksogent uttrykker fluorescerende proteiner for å avgrense fysiske egenskaper. Injiserbare fargestoffer og substrater som fluorescerende dextrans brukes i stor grad til å merke vaskulaturen i intravitale samlinger19, 23, 24. Denne tilnærmingen er imidlertid ikke uten begrensninger. For det første krever det ytterligere musemanipulasjoner, og verktøyet er begrenset til kortsiktige eksperimenter. For langsgående studier kan fluorescerende dextran være problematisk når vi observerer opphopning av dekstran i fagocytiske celler eller diffusjon i det omkringliggende vevet over tid25. Eksogen fluorescerende protein inkorporering i musemodellen har blitt presentert som et alternativ til fluorescerende dextrans, men presenterer begrensninger av seg selv. Tilgjengeligheten og mangfoldet av eksogene fluoroforer i musemodeller er fortsatt begrenset og dyrt å lage. I tillegg, i spesifikke modeller, for eksempel PDX-modeller, er genetiske manipulasjoner ikke ønskelige eller mulige. Det har også vist seg at tilstedeværelsen av fluorescerende eller bioluminescerende proteiner i celler er anerkjent som fremmed i musen, og innenfor immunkompetente musemodeller reduserer dette mengden metastase på grunn av responsen fra vertsimmunsystemet26,27. Til slutt opptar eksogene fluorescerende proteiner eller fluorescerende fargestoffer som brukes til romlig kontekst eller for å segmentere etterfølgende data ofte hovedområder i lysspekteret som ellers kunne brukes til å undersøke de fysiologiske interaksjonene av interesse.
Bruken av det iboende signalet fra ECM eller endogen fluorescens fra celler i vevet representerer et potensielt universelt etikettfritt middel for å segmentere intravitale data for mer dyptgående cellulær og romlig analyse. Andre harmoniske generasjon (SHG) har lenge vært brukt til å visualisere ECM28. Med den påfølgende utviklingen av viktige verktøy for å hjelpe til med karakteriseringen av fiberorganisasjon 29,30,31, er det mulig å karakterisere celleadferd i forhold til lokal ECM-struktur. I tillegg gir autofluorescence fra den endogene metabolitten, NAD (P)H, et annet etikettfritt verktøy for å dele opp tumormikromiljøet in vivo. NAD(P)H fluoresces sterkt i tumorceller og kan brukes til å diskriminere grensene til den voksende svulstreiret fra sin omkringliggende stroma 21,32. Til slutt er vaskulaturen en viktig fysiologisk struktur i tumormikromiljøet og stedet for nøkkelcellespesifikke interaksjoner 33,34,35. Eksitasjonen av røde blodlegemer (RBC) eller blodplasma har blitt brukt til å visualisere tumorvaskulaturen, og ved hjelp av to- eller trefotoneksitasjon (2P; 3P) har målingen av blodstrømshastigheter vist seg å være mulig36. Men mens større blodårer er lett identifiserbare ved deres endogene fluorescenssignaturer, krever identifisering av subtile, variable og mindre fluorescerende små blodkar mer kompetanse. Disse iboende vanskelighetene hindrer optimal bildesegmentering. Heldigvis kan disse kildene til endogen fluorescens (dvs. røde blodlegemer og blodplasma) også måles ved fluorescens levetidsavbildning37, som utnytter de unike fotofysiske egenskapene til vaskulaturen og representerer et nyttig tillegg til den voksende intravitale verktøykassen.
I denne protokollen beskrives en arbeidsflyt for segmentering av firedimensjonal (4D) intravital avbildning eksplisitt ved hjelp av iboende signaler som endogen fluorescens og SHG fra oppkjøp til analyse. Denne protokollen er spesielt relevant for langsgående studier gjennom et pattedyravbildningsvindu der eksogen fluorescens kanskje ikke er praktisk eller mulig, slik tilfellet er med PDX-modeller. Segmenteringsprinsippene som er skissert her, gjelder imidlertid bredt for intravitale brukere som undersøker tumorbiologi, vevsutvikling eller til og med normal vevsfysiologi. Den rapporterte pakken med analysetilnærminger vil tillate brukerne å skille cellulær oppførsel mellom regioner med justerte eller tilfeldige kollagenfiberkonfigurasjoner, sammenligne tall eller oppførsel av celler som bor i bestemte områder av tumormikromiljøet, og kartlegge vaskulaturen til tumormikromiljøet ved hjelp av bare etikettfritt eller iboende signal. Sammen skaper disse metodene et operativt rammeverk for å maksimere dybden av informasjon oppnådd fra 4D intravital avbildning av brystkjertelen samtidig som behovet for ekstra eksogene etiketter minimeres.
4D intravital avbildning er et kraftig verktøy for å undersøke dynamiske fysiologiske interaksjoner innenfor den romlige og tidsmessige konteksten til det opprinnelige tumormikromiljøet. Dette manuskriptet gir et veldig grunnleggende og tilpasningsdyktig operasjonelt rammeverk for å dele opp dynamiske celleinteraksjoner i tumormassen, det tilstøtende stromaet, eller i nærheten av det vaskulære nettverket ved hjelp av bare endogene signaler fra andre harmoniske generasjon eller NAD (P) H autofluorescence. Denne pr…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å anerkjenne NCI R01 CA216248, CA206458 og CA179556 tilskudd til finansiering av dette arbeidet. Vi vil også gjerne anerkjenne Dr. Kevin Eliceiri og hans bildegruppe for deres tekniske ekspertise i den tidlige utviklingen av vårt intravitale program. Vi takker også Dr. Ben Cox og andre medlemmer av Eliceiri Fabrication Group ved Morgridge Institute for Research for deres essensielle tekniske design i de tidlige fasene av MIW. Dr. Ellen Dobson assisterte med nyttige samtaler om ImageJ-verktøyet for trenbar WEKA-segmentering. I tillegg vil vi takke Dr. Melissa Skala og Dr. Alexa Barres-Heaton for rettidig bruk av mikroskopet deres. Til slutt vil vi takke Dr. Brigitte Raabe, D.V.M, for alle gjennomtenkte diskusjoner og råd om vår musehåndtering og omsorg.
#1.5 12mm round cover glass | Warner Instruments | # 64-0712 | MIW construction |
1.0 mL syringe for SQ injection | BD | 309659 | Syringe |
20x objective | Zeiss | 421452-988 | Water immersion |
27G needle for SQ injection | Covidien | 1188827012 | Needle |
40x objective | Nikon | MRD77410 | Water immersion |
5-0 silk braided suture | Ethicon | K870 | Suture for MIW implantation |
Artificial tears gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | Eye gel |
Betadine solution, 5% | Fisher Scientific | NC1558063 | Surgery antiseptic |
cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | MIW construction |
fluorescent dextran | Sigma | T1287-50mg | intravenous labelling of vasculature |
forceps | Mckesson.com | Miltex #18-782 | stainless, 4 inch, curved |
GaAsP photomultiplier tube | Hamamatsu | ||
heating blanket | CARA 72 heating pad | 038056000729 | Temperature selectable |
heating chamber | home built | ||
Fluorescent lifetime handbook | Becker and Hickl | https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks | |
inverted microscope base | Nikon | ||
Isoflurane | Akorn | NDC 59399-106-01 | Anesthesia |
Liqui-Nox | Fisher Scientific | 16-000-125 | MIW cleaning |
Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | Analgesic |
Micro Hose | Scientific Commodities INC. | BB31695-PE/1 | |
multiphoton scan head | Bruker Ultima II | Multiphoton scanhead and imaging platform | |
NADH FLIM filter | Chroma | 284994 | ET 440/80 m-2P |
Nair | CVS | 339826 | Depilatory cream |
objective heater | Tokai Hit | STRG-WELSX-SET | |
SHG/FAD filter | Chroma | 320740 | ET450/40m-2P |
Sparkle glass cleaner | Amazon.com | B00814ME24 | Glass Cleaner for implanted MIW |
SPC-150 photon counting board | Becker and Hickl | ||
surgical light | FAJ | B06XV1VQVZ | Magnetic LED gooseneck light |
surgical micro-scissors | Excelta | 366 | stainless, 3 inch |
Triple antibiotic ointment | Actavis Pharma | NDC 0472-0179-34 | Antibiotic |
TV catheter | Custom | BD 30G needle: 305106 | Catheter for TV injection |
Two photon filter | Chroma | 320282 | ET585/65m-2P |
two-photon laser | Coherent charmeleon | Tunable multiphoton laser | |
ultrasound gel | Parker | PKR-03-02 | Water immersion gel |
Urea crystals | Sigma | U5128-5G | Optional: FLIM IRF |