Her præsenterer vi en ligetil protokol for ikke-invasiv genetisk prøveudtagning af sommerfuglepopulationer baseret på feltindsamling af resterende ægrestaffald. Det kan bruges til at bekræfte artsidentitet og kvantificere genetisk variation. Denne protokol kan let tilpasses bredere grupper til samfundsvidenskabelig involvering.
Den globale nedgang i antallet af insekter fortsætter med at accelerere. Effektiv genetisk prøveudtagning er kritisk nødvendig for at fremme forståelsen af mange taxa og løse eksisterende videnshuller. Denne protokol repræsenterer en demonstreret metode til ikke-destruktiv prøveudtagning af sjældne sommerfugle til populationsgenetisk struktur eller DNA-stregkodningsanalyser. Det bruger chorion af udklækket sommerfugl ovae til at give tilstrækkelig høj mængde og kvalitet DNA til vellykket gensekventering for at bekræfte artsidentitet og kvantificere genetisk variation. Det kan især være nyttigt, når andre vævsprøvetagningsteknikker er upraktiske eller utilgængelige. Selvom den er udviklet til en lepidopteran, kan den ikke desto mindre let tilpasses til brug med andre insektarter. Det blev specielt designet med brugervenlighed som et mål for at hjælpe med at maksimere bred implementering af enkeltpersoner med varierende erfaring og færdighedsniveauer, såsom samfundsforskere, bevaringsudøvere og studerende, og til brug over store geografiske områder for at lette bred befolkningsprøveudtagning. De genererede data kan hjælpe med at informere taksonomiske og noteringsbeslutninger, bevarings- og forvaltningsforanstaltninger og forbedre grundlæggende økologisk forskning.
Effektiv populationsgenetisk prøveudtagning af sjældne, faldende og/eller listeopførte insekttaxa er ofte afgørende for at hjælpe med at informere bevarings- og forvaltningsforanstaltninger. Dødelige eller skadelige vævsprøvetagningsmetoder anvendes rutinemæssigt til mange genetiske analyser. Disse metoder er imidlertid uønskede eller ikke tilladt, fordi de kan forårsage skade på sårbare eksisterende befolkninger eller påvirke adfærd og fitness negativt. Forskellige ikke-dødelige eller ikke-invasive prøveudtagningsteknikker, der involverer væv såsom hele ben, antenne- eller vingeklip, larveeksuviae eller hæmolymfe fra defensive sekreter og andre produkter, såsom frass, har været egnede til insektgenetisk forskning 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Den samlede gennemførlighed og anvendelighed af disse forskellige vævsprøvetagningsteknikker varierer betydeligt baseret på biologi, økologi, adfærd, størrelse og sjældenhed af fokusorganismen, situationen og individer, der indsamler materialet. For eksempel kræver hele ben eller vedhængsklip midlertidig fangst og omhyggelig håndtering af flere personer i et passende livsstadium, typisk af erfarent personale. På samme måde vil vævskilder, såsom larveeksuviae eller frass, sandsynligvis kun være praktiske, hvis organismerne er i fangenskab eller midlertidigt holdes i en passende periode.
For forskningsspørgsmål, der stilles på befolkningsniveau, såsom dem, der vedrører potentiel taksonomisk differentiering eller genetisk struktur, er prøveudtagning i en bredere tidsmæssig eller geografisk skala (dvs. regional eller kontinental) ofte påkrævet. Som følge heraf kan visse ikke-invasive vævskilder være fuldstændig upraktiske eller i det mindste ineffektive at indsamle i mængde. Prøveindsamling i sådanne skalaer kan desuden være logistisk eller økonomisk upraktisk eller uoverkommelig for individuelle forskere eller endnu mindre felthold at foretage. Mens det direkte engagement fra samfundsforskere i stigende grad er blevet vedtaget af forskersamfundet for at hjælpe med at løse mange af disse udfordringer og fremskynde big data-drevet indsamling, har vedtagelsen været begrænset til undersøgelser, der involverer ikke-destruktiv, ikke-invasiv eller eDNA-prøveudtagning10,11,12.
For at hjælpe med at overvinde nogle af disse potentielle begrænsninger demonstrerede vi, at chorionen fra klækkede sommerfuglovae kunne give tilstrækkelig høj mængde og kvalitets-DNA til vellykket gensekventering for at bekræfte artsidentitet og kvantificere genetisk variation. Vi testede efterfølgende forskellige indsamlingsprotokoller ved hjælp af denne teknik13. Dette pilotarbejde tjente som grundlag for yderligere metodologisk forfining. Dette papir beskriver detaljeret den resulterende enkle, men omfattende reviderede feltindsamlingsprotokol, der blev rullet ud for samfundsforskere og andet ikke-ekspertpersonale. Denne protokol er en del af en omfattende populationsstrukturanalyse af den frostede elversommerfugl (Callophrys irus) for at hjælpe med at informere fremtidige bevaringsforanstaltninger og en føderal bestemmelse af muligvis notering i henhold til den amerikanske lov om truede arter. Selvom det potentielt er mere arbejdskrævende end nogle ikke-invasive metoder, gør manglen på nødvendig organismekontakt og brugervenlighed det til en potentielt levedygtig model, der kan anvendes på andre populationsgenetiske forskningsprogrammer rettet mod et udvalg af både almindelige insekter og dem af bevaringsbekymring, som efterlader resterende ægrester fra nyligt udklækkede nymfer eller larver. Protokolsproget, der præsenteres her, blev specielt udviklet til sommerfugle i familien Lycaenidae og til brug for ikke-eksperter, der her er defineret som samfundsforskere eller andre individer (f.eks. Agenturbiologer, praktikanter) med begrænset entomologisk erfaring.
Denne protokol beskriver en feltmetode til ikke-destruktiv prøveudtagning af sjældne sommerfugle til populationsgenetisk struktur eller DNA-stregkodningsanalyser. De overordnede fordele ved denne protokol er specielt designet til at hjælpe med at maksimere bred implementering af enkeltpersoner med varierende erfaring og færdighedsniveauer såsom samfundsforskere, bevaringsudøvere og studerende. Disse omfatter relativt lave samlede omkostninger, let at erhverve forsyninger og udstyr, en ligetil og tilgængelig metode uden mange alt for komplekse trin og nem implementering over et bredt geografisk område. Det er desuden rettet mod resterende organisk materiale, der eliminerer behovet for midlertidigt at fange eller manipulere og i processen potentielt skade levende organismer for at erhverve genetiske prøver. Desuden forlænger det den potentielle periode, der er tilgængelig for prøveindsamling ud over den traditionelle fænologi eller levetid for et bestemt livsstadium, hvilket øger fleksibiliteten og den samlede indsamlingsmulighed for at hjælpe med at maksimere antallet af prøver.
Mens den centrale taxon for denne indsats var den frostede elfinsommerfugl, en udbredt, men faldende habitatspecialist, kan denne protokol anvendes mere bredt på mange andre insekter, herunder dem, der er af bevaringsmæssig bekymring. På samme måde kan protokollen, selv om den er rettet mod indsamling af rugeæg som kilde til genetisk materiale, let tilpasses andre, potentielt mere traditionelle prøver (f.eks. ben, vingefragmenter, antenneklip) eller endda hele organismer. Dette aspekt er imidlertid også en potentiel begrænsning af protokollen. Selvom langt de fleste trin er designet til at være relativt enkle og hurtige at udføre, er omfattende søgning af pletter af larveværtsplanter efter rugeæg, som individuelt typisk er <1,0 mm i diameter, tids- og arbejdskrævende. Ikke desto mindre er en sådan omfattende prøveudtagningsaktivitet særlig ideel til et større netværk af deltagere såsom samfundsforskere.
Som med andre feltbaserede projekter er omhyggelig forberedelse afgørende. Dette inkluderer at foretage en komplet oversigt over de forsyninger, der er nødvendige for at sikre, at der ikke mangler varer, at alt nødvendigt forberedelsesarbejde er afsluttet, og de er velorganiserede, sikkert pakket og klar til implementering i marken. Derudover bør alt personale i marken, især dem, der foretager vævsindsamlingen, gennemgå indsamlingsprotokollen i detaljer forud for enhver indsamlingsbegivenhed og rette eventuelle spørgsmål til personer, der fører tilsyn med projektet. En gang i marken kræver prøveindsamlingsdelen af protokollen omhyggelig opmærksomhed på detaljer. Dette omfatter lokalisering og omhyggelig inspektion af eventuelle æg for at sikre, at de er udklækket og dermed egnede til indsamling, grundig rengøring af tang, udskiftning af handsker for at reducere vævsoverførsel mellem prøveudtagningshændelser og sikring af, at vævsprøver er helt nedsænket i lysisbuffer inden for hvert 1,5 ml mikrocentrifugerør. Endelig er det vigtigt at registrere nøjagtige og detaljerede data, hvilket omfatter sammenkædning af den unikke ID-etiket, der er tildelt fra mikrocentrifugerøret, med den specifikke prøve, der er taget, og alle andre relevante indsamlingsoplysninger. Selvom dette trin er rutine inden for videnskabelig forskning, skal det ofte afklares grundigt og styrkes for et samfundsvidenskabeligt publikum.
Her demonstrerer vi den potentielle udnyttelse af samfundsforskere til ikke-dødelig prøveindsamling fra små, sjældne og truede arter. Der er dog nogle potentielle begrænsninger at huske på, når man analyserer eventuelle resulterende genetiske data. For eksempel, mens pooling af prøver fra et enkelt plaster øger chancerne for at genvinde nok DNA til påvisning, introducerer det også potentielt heterozygositet. Derudover, da protokollen involverer indsamling af chorion fra udklækkede æg, kan kun kvindelige sommerfugle, der repræsenterer forældrenes DNA, udtages inden for en befolkning. Ikke desto mindre, da der ikke var nogen tidligere genetiske data på populationsniveau til rådighed for C. irus, kan den opnåede indsigt kun gavne bevarelse og forvaltning af arter. Selv om det f.eks. ville være nødvendigt med et grundigt, detaljeret undersøgelsesdesign og omhyggelig markeringsudvælgelse for at kunne vurdere populationsstrukturen tilstrækkeligt, kunne den prøveudtagningsprotokol, der er skitseret her, og anvendelsen af cytokrom c oxidase subunit 1 (CO1) DNA-stregkodning anvendes til at detektere forekomsten af sjældne eller truede taxa. Yderligere diskussion af nytten og anvendelsen af DNA-sekventering fra ikke-dødelig prøveudtagning beskrevet her er detaljeret af Storer et. al.14.
Ud over det primære mål om at indsamle prøver til genetisk analyse understreger protokollen også, at deltagerne tager detaljerede digitale fotografier af alle feltsteder, indsamlingssteder, larveværtsplanter, der er til stede, og andre elementer i det omgivende habitat, der kan være relevante. En sådan dokumentation hjælper med at give en generel habitatvurdering, der er nyttig til at illustrere eksisterende lokalitetsforhold såsom plantefænologi, værtsressourcetæthed og forvaltningshistorie (f.eks. nylig foreskrevet brand). Sådanne oplysninger er især nyttige i forbindelse med projekter, hvor der udtages stikprøver over en længere tidsmæssig periode for at muliggøre mere detaljerede miljøsammenligninger.
Endelig, da den globale insektnedgang fortsætter med at accelerere, er der kritisk behov for en udvidet artsvurderings- og overvågningsindsats15,16. Brugen af mere udbredt deltagende engagement fra samfundsforskere, studerende (f.eks. U.S. Fish and Wildlife Service praktikanter og stipendiater) og bevaringsudøvere giver stadig mere levedygtige muligheder for omfattende dataindsamling af mange typer, herunder DNA-prøver. Derfor har de data, der genereres fra denne protokol, mange mulige anvendelser. Disse omfatter hjælp til at informere bevaringsforanstaltninger (f.eks. Planlægning, genopretning og forvaltning), listebeslutninger eller vurderinger af artsstatus og økologisk, befolkningsmæssig og taksonomisk forskning.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker at takke David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge og Jessup Weichelt for hjælp med forskellige aspekter af projektet, herunder logistik, koordinering, tilladelse og / eller prøveindsamling. Denne forskning blev finansieret gennem et tilskud fra US Fish and Wildlife Service (Federal Award Identification Number F20AC00356) administreret af Wildlife Management Institute (tilskud SA 2021-01).
14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton – Hot Pink – Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
packing material Amount per deployable unit: as needed |