बटेर कोरियोलैंटोइक झिल्ली - फोटोडायनामिक निदान और चिकित्सा के लिए एक उपकरण
Summary
एवियन भ्रूण का कोरियोलैंटोइक झिल्ली (सीएएम) अनुसंधान के विभिन्न क्षेत्रों के लिए एक बहुत ही उपयोगी और लागू उपकरण है। जापानी बटेर सीएएम का एक विशेष एक्स ओवो मॉडल फोटोडायनामिक उपचार जांच के लिए उपयुक्त है।
Abstract
एक एवियन भ्रूण का कोरियोलैंटोइक झिल्ली (सीएएम) एक पतली, एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक झिल्ली है जो प्राथमिक श्वसन अंग के रूप में कार्य करती है। इसके गुण एंजियोजेनेसिस, ट्यूमर विकास, दवा वितरण प्रणाली, या फोटोडायनामिक निदान (पीडीडी) और फोटोडायनामिक थेरेपी (पीडीटी) का अध्ययन करने के लिए विवो प्रयोगात्मक मॉडल में एक उत्कृष्ट बनाते हैं। इसी समय, यह मॉडल एक उपयुक्त विकल्प के साथ प्रयोगात्मक जानवरों के प्रतिस्थापन की आवश्यकता को संबोधित करता है। एक्स ओवो खेती भ्रूण आसान पदार्थ अनुप्रयोग, पहुंच, निगरानी और प्रलेखन की अनुमति देता है। सबसे अधिक बार इस्तेमाल किया जाता है चिक सीएएम; हालाँकि, यह लेख जापानी बटेर सीएएम के फायदों को कम लागत और उच्च-थ्रूपुट मॉडल के रूप में वर्णित करता है। एक और लाभ छोटा भ्रूण विकास है, जो उच्च प्रयोगात्मक कारोबार की अनुमति देता है। कैंसर और माइक्रोबियल संक्रमण के पीडीडी और पीडीटी के लिए बटेर सीएएम की उपयुक्तता का पता यहां लगाया गया है। एक उदाहरण के रूप में, वितरण प्रणाली के रूप में लिपोप्रोटीन या नैनोकणों के साथ संयोजन में फोटोसेंसिटाइज़र हाइपरिसिन का उपयोग वर्णित है। सफेद प्रकाश में छवियों से क्षति स्कोर और बैंगनी प्रकाश (405 एनएम) के तहत सीएएम ऊतक की प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन हिस्टोलॉजिकल वर्गों के विश्लेषण के साथ निर्धारित किया गया था। बटेर सीएएम ने स्पष्ट रूप से वाहिका और ऊतक पर पीडीटी के प्रभाव को दिखाया। इसके अलावा, केशिका रक्तस्राव, घनास्त्रता, छोटी वाहिकाओं का लाइसिस और बड़ी वाहिकाओं के रक्तस्राव जैसे परिवर्तन देखे जा सकते हैं। जापानी बटेर सीएएम फोटोडायनामिक निदान और चिकित्सा अनुसंधान के लिए विवो मॉडल में एक आशाजनक है, जिसमें ट्यूमर एंजियोजेनेसिस के अध्ययन के साथ-साथ एंटीवास्कुलर और रोगाणुरोधी चिकित्सा के अनुप्रयोग हैं।
Introduction
चिकन कोरिओलैंटोइक झिल्ली (सीएएम) मॉडल अच्छी तरह से जाना जाता है और अनुसंधान के विभिन्न क्षेत्रों में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। यह एक समृद्ध संवहनी एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक अंग है जो गैस विनिमय और खनिज परिवहन प्रदान करता है। इस झिल्ली की पारदर्शिता और पहुंच के कारण, व्यक्तिगत रक्त वाहिकाओं और उनके संरचनात्मक परिवर्तनों को वास्तविक समय में देखा जा सकताहै। फायदों के बावजूद, चिक सीएएम की कुछ सीमाएं भी हैं (जैसे, बड़ी प्रजनन सुविधाएं, अंडे का उत्पादन, और फ़ीड की खपत) जिन्हें अन्य एवियन प्रजातियों का उपयोग करके टाला जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, जापानी बटेर (कोटरनिक्स जैपोनिका) भ्रूण का उपयोग करके एक वैकल्पिक एक्स ओवो सीएएम मॉडल का वर्णन किया गया है। अपने छोटे आकार के कारण, यह चिकन सीएएम की तुलना में प्रयोगात्मक व्यक्तियों की बहुत बड़ी संख्या के उपयोग की अनुमति देता है। इसके अलावा, बटेर भ्रूण का छोटा 16-दिवसीय भ्रूण विकास एक और लाभ है। बटेर सीएएम पर पहले बड़े जहाज भ्रूण दिवस (ईडी) 7 पर दिखाई देते हैं। इसकी तुलना सीधे चूजे के भ्रूण के विकास (चरण 4-35) के साथ की जा सकती है; हालांकि, विकास के बाद के चरण अब तुलनीय नहीं हैं और बटेर भ्रूण 3 के लिए कम समय की आवश्यकता होतीहै। दिलचस्पी चिकन सीएएम 4,5,6 के समान माइक्रोवैस्कुलर शाखाओं की नियमित घटना है। तेजी से यौन परिपक्वता, उच्च अंडा उत्पादन, और कम लागत वाले प्रजनन अन्य उदाहरण हैं जो इस प्रयोगात्मक मॉडल7 के उपयोग का पक्ष लेते हैं।
एक एवियन सीएएम मॉडल का उपयोग अक्सर फोटोडायनामिक थेरेपी (पीडीटी) अध्ययनमें किया जाता है। पीडीटी का उपयोग कैंसर के कई रूपों (छोटे स्थानीय ट्यूमर) और अन्य गैर-ऑन्कोलॉजिकल रोगों के इलाज के लिए किया जाता है। इसका सिद्धांत एक फ्लोरोसेंट दवा, एक फोटोसेंसिटाइज़र (पीएस) के वितरण में है, क्षतिग्रस्त ऊतक को और उचित तरंग दैर्ध्य के प्रकाश के साथ इसकी सक्रियता। अनुसंधान में उपयोग किया जाने वाला एक संभावित पीएस हाइपरिसिन है, जो मूल रूप से औषधीय पौधे सेंट जॉन पौधा (हाइपरिकम परफोराटम) 9 से अलग है। इस यौगिक के मजबूत फोटोसेंसिटाइजिंग प्रभाव इसके फोटोकैमिकल और फोटोफिजिकल गुणों पर आधारित हैं। इन्हें 400-600 एनएम रेंज में कई फ्लोरेसेंस उत्तेजना चोटियों की विशेषता है, जो लगभग 600 एनएम पर प्रतिदीप्ति के उत्सर्जन को प्रेरित करते हैं। वर्णक्रमीय बैंड के भीतर हाइपरिसिन का अवशोषण मैक्सिमा 540-590 एनएम रेंज में है, और फ्लोरेसेंस मैक्सिमा 590-640 एनएम रेंज9 में है। इन फोटोसेंसिटाइजिंग प्रभावों को प्राप्त करने के लिए, हाइपरिसिन स्थानीय प्रशासन10 के बाद 405 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर लेजर प्रकाश द्वारा उत्तेजित होता है। प्रकाश की उपस्थिति में, हाइपरिसिन विरुसाइडल, एंटीप्रोलिफेरेटिव और साइटोटॉक्सिक प्रभाव11 प्रदर्शित कर सकता है, जबकि कोई प्रणालीगत विषाक्तता नहीं है, और यह जीव से तेजी से जारी होता है। हाइपरिसिन एक लिपोफिलिक पदार्थ है जो पानी-अघुलनशील, गैर-फ्लोरोसेंट समुच्चय बनाता है, यही कारण है कि कई प्रकार के नैनोकैरियर, जैसे बहुलक नैनोकणों 12,13 या उच्च और निम्न घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एचडीएल, एलडीएल) 14,15, का उपयोग कोशिकाओं में इसके वितरण और प्रवेश में मदद करने के लिए किया जाता है। चूंकि सीएएम एक स्वाभाविक रूप से इम्यूनोडेफिशिएंट सिस्टम है, ट्यूमर कोशिकाओं को सीधे झिल्ली की सतह पर प्रत्यारोपित किया जा सकता है। मॉडल एक परिभाषित स्कोर16,17 के अनुसार पीडीटी-प्रेरित संवहनी क्षति की सीमा को रिकॉर्ड करने के लिए भी उपयुक्त है। पीडीटी की तुलना में कम तीव्रता के प्रकाश का उपयोग फोटोडायनामिक निदान (पीडीडी) के लिए किया जा सकता है। बैंगनी उत्तेजना एलईडी प्रकाश के तहत ऊतक की निगरानी से फोटोसेंसिटाइज़र18,19,20 का फोटोएक्टिवेशन भी होता है जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट प्रकाश का उत्सर्जन होता है, फिर भी यह पीडीटी प्रतिक्रिया शुरू करने और कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने के लिए पर्याप्त ऊर्जा प्रदान नहीं करता है। यह ट्यूमर विज़ुअलाइज़ेशन और निदान या प्रयुक्त पीएसएस14,15 के फार्माकोकाइनेटिक्स की निगरानी के लिए एक अच्छा उपकरण बनाता है।
यह लेख 80% से अधिक जीवित रहने की दर के साथ बटेर एक्स ओवो सीएएम परख की तैयारी का वर्णन करता है। इस एक्स ओवो संस्कृति को बड़ी संख्या में प्रयोगों में सफलतापूर्वक लागू किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
सफल एक्स ओवो खेती के लिए, ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल का पालन करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यदि अंडे को पर्याप्त सावधानी से नहीं खोला जाता है या खेती के दौरान अपर्याप्त आर्द्रता होती है, तो जर्दी की बोरी ख?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
काम वीईजीए 2/0042/21 और एपीवीवी 20-0129 द्वारा समर्थित था। हंटोसोवा का योगदान परियोजना कार्यान्वयन का परिणाम है: चिकित्सा में आधुनिक अंतःविषय अनुसंधान के लिए खुला वैज्ञानिक समुदाय (संक्षिप्त नाम: ओपनमेड), आईटीएमएस 2014 +: 313011वी 455 परिचालन कार्यक्रम एकीकृत बुनियादी ढांचे द्वारा समर्थित, ईआरडीएफ द्वारा वित्त पोषित।
Materials
| 6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
| CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
| digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
| diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
| eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| incubator Bios Midi | Bios Sedl any, Czech Republic |
Forced draught incubator for initial incubation | |
| incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
| Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
| LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
| macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
| microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
| microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
| scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
| software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
| stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
| stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |
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