Micro-CT è uno strumento non distruttivo in grado di analizzare le strutture delle piante in tre dimensioni. Il presente protocollo descrive la preparazione del campione per sfruttare la micro-CT per analizzare la struttura e la funzione delle piante parassite. Diverse specie sono utilizzate per evidenziare i vantaggi di questo metodo se accoppiato con preparazioni specifiche.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Sfruttare la scansione micro-CT per analizzare le interazioni parassitarie pianta-ospite
In questo articolo
Sommario
Abstract
La scansione micro-CT è diventata uno strumento consolidato nello studio della struttura e della funzione dell'impianto. La sua natura non distruttiva, unita alla possibilità di visualizzazione tridimensionale e sezionamento virtuale, ha permesso analisi nuove e sempre più dettagliate di organi vegetali complessi. Possono anche essere esplorate le interazioni tra le piante, comprese quelle tra le piante parassite e i loro ospiti. Tuttavia, la preparazione del campione prima della scansione diventa cruciale a causa dell'interazione tra queste piante, che spesso differiscono nell'organizzazione e nella composizione dei tessuti. Inoltre, l'ampia diversità delle piante da fiore parassite, che vanno dai corpi vegetativi altamente ridotti agli alberi, alle erbe e agli arbusti, deve essere considerata durante il campionamento, il trattamento e la preparazione del materiale ospite del parassita. Qui vengono descritti due diversi approcci per introdurre soluzioni di contrasto nel parassita e/o nelle piante ospiti, concentrandosi sull'analisi dell'haustorium. Questo organo promuove la connessione e la comunicazione tra le due piante. Seguendo un approccio semplice, i dettagli dell'organizzazione del tessuto haustorium possono essere esplorati tridimensionalmente, come mostrato qui per le specie parassite eufitoidi, vite e vischio. La selezione di specifici agenti di contrasto e approcci applicativi consente anche un'osservazione dettagliata della diffusione dell'endoparassita all'interno del corpo ospite e il rilevamento della connessione diretta vaso-vaso tra parassita e ospite, come mostrato qui per un parassita radice obbligato. Pertanto, il protocollo discusso qui può essere applicato all'ampia diversità delle piante da fiore parassite per far progredire la comprensione del loro sviluppo, struttura e funzionamento.
Introduzione
La tomografia microcomputerizzata a raggi X ad alta risoluzione (micro-CT) è un metodo di imaging in cui più radiografie (proiezioni) di un campione vengono registrate da diversi angoli di visione e successivamente utilizzate per fornire una ricostruzione virtuale del campione1. Questo oggetto virtuale può quindi essere analizzato, manipolato e segmentato, consentendo l'esplorazione non distruttiva in tre dimensioni2. Inizialmente progettata per analisi mediche e successivamente per applicazioni industriali, la micro-CT offre anche il vantaggio di visualizzare organi interni e tessuti senza la necessità di procedure inva....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Selezione del campione di piante parassite
- Raccogliere l'intero haustorio della pianta parassita, compreso il fusto / radice dell'ospite attaccato e segmenti di entrambe le estremità prossimali e distali dell'organo ospite parassitato; La lunghezza ideale di ogni segmento equivale al doppio del diametro dell'haustorium.
NOTA: Per l'haustoria laterale, includere parte del fusto/radice madre del parassita da cui si è formato l'haustorio (Figura 1A,B,D). Per gli endoparassiti, raccogliere un segmento dello stelo/radice ospite in cui sono visibili i segni del parassita (Fi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
L'haustorio delle piante parassite è un organo complesso che comprende diversi tessuti e tipi di cellule che si intrecciano e si collegano con i tessuti di un'altra pianta, utilizzata come ospite20. La scansione micro-CT può essere sfruttata per comprendere meglio questa complessa struttura in modo non distruttivo e tridimensionale quando si analizzano sia piccole (Figura 1A-C) che grandi (Figura 1D,E) haustoria........
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
L'uso di soluzioni di metalli pesanti per migliorare il contrasto dei tessuti vegetali è diventato un passo cruciale nella preparazione del campione per l'analisi micro-CT. Diversi composti comunemente disponibili nei laboratori di micromorfologia vegetale sono stati testati da Staedler et al., che raccomandano l'uso del fosfotungstato come agente più efficace nel penetrare i campioni e aumentare l'indice di contrasto8. I risultati ottenuti qui nell'analisi dell'haustorium di P. pubera co.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
L'autore non ha nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorrei ringraziare il Dr. Simone Gomes Ferreira (Microtomography Laboratory, Università di San Paolo, Brasile) e il Dr. Greg Lin (Center for Nanoscale Systems, Harvard University, USA) per il loro fondamentale aiuto e indispensabile formazione degli utenti per diversi sistemi di microtomografia e software di analisi dei dati. Ringrazio anche il personale della serra EEB dell'Università del Connecticut (USA), in particolare Clinton Morse e Matthew Opel per aver fornito gli esemplari di Viscum minimo. Il Dr. John Wenzel ha fornito l'opportunità e un grande aiuto per il campionamento di Pyrularia pubera. Carolina Bastos, Yasmin Hirao e Talitha Motta han....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| microscopio a raggi X 3D (XRM) | Zeiss Versa 620 | utilizzato per la scansione di Pyrularia pubera | |
| Microscopio a raggi X 3D + A2:D22 | Zeiss | Versa 620 | Utilizzato per la scansione delle specie P. pubera |
| CT-Pro Software 3D | Nikon | versione XT 3.1.11 | Utilizzato per la ricostruzione tridimensionale delle scansioni |
| Software CT-Vox | Bruker | versione 3.3.1 | Utilizzato per l'analisi e l'acquisizione di immagini e video |
| Software Dragonfly | Object Research Systems - Versione ORS | Utilizzato per l'analisi e l'acquisizione di immagini e video | |
| Fiale di vetro | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | Venduto da VWR - USA; assicurarsi che le fiale siano in grado di resistere al vuoto a circa 10 psi |
| Inspect-X | Zeiss | versione XT 3.1.11 | Utilizzato per il controllo del sistema di HMXST225 Nikon X-Tek |
| Soluzione di iodio 0,0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | Venduto da VWR - USA |
| Nitrato di piombo II PA 500 g | Vetec | 361.08 | Venduto da SPLab |
| Scanner per microtomografia | Bruker | Skyscan1176 | Utilizzato per la scansione delle specie C. americana, S. martianus, e S. fungiforme |
| Scanner per microtomografia | Nikon | X-Tek HMXST225 | Utilizzato per la scansione delle specie V. minimum |
| NRecon software | Bruker | versione 1.0.0 | Utilizzato per la ricostruzione tridimensionale |
| Acido fosfotungstico idrato 3% in soluzione acquosa | Microscopia elettronica | Sciences 101410-756 | Venduto da VWR - USA |
| Film plastico (Parafilm) | Heathrow Scientific | PM996 | Venduto da VWR - USA |
| Sacca IV in plastica 500 mL | Taylor | 3478 | Venduto da Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
| Tubo in PVC 3/4'' | Nalge Nunc International | SC63013-164 | Venduto da VWR - USA |
| Sistema di scansione | Nikon X-Tek HMXST225 | utilizzato per scansionare Viscum minimum | |
| Sistema di scansione | Bruker Skyscan 1176 | utilizzato per la scansione C. americana | |
| lo stantuffo | |||
| Raccoglitore a camera a vuoto | 80080-434 | Venduto da VWR - USA; include pompa e tubi di collegamento | |
| Software VG Studio Max | Volume Graphics | versione 3.0 | Utilizzato per analisi e acquisizione di immagini e video |
Riferimenti
- Stock, S. R. Microcomputed tomography: Methodology and applications. , CRC Press/Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2020).
- Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
