这里描述了一种使植物组织透明同时保持荧光蛋白稳定性的方法。该技术有助于对清除的植物组织进行深度成像,而无需物理切片。
在显微镜下直接观察多层和不透明植物标本的内部结构而不进行解剖是具有挑战性的。此外,归因于叶绿素的自发荧光阻碍了植物中荧光蛋白的观察。长期以来,各种清除试剂已被用于使植物透明。然而,传统的清除试剂会减少荧光信号;因此,已经不可能用荧光蛋白观察细胞和细胞内结构。开发的试剂可以通过去除叶绿素来清除植物组织,同时保持荧光蛋白的稳定性。这里提供了详细的方案,用于使用清除试剂ClearSee(CS)或ClearSeeAlpha(CSA)对植物组织进行光学清除。清除的植物组织的制备包括三个步骤:固定,洗涤和清除。固定是维持荧光蛋白的细胞结构和细胞内稳定性的关键步骤。清除的孵育时间取决于组织类型和种类。在 拟南芥中,用CS清除叶和根所需的时间为4天,幼苗7天,雌蕊1个月。CS还需要相对较短的4天时间才能使 Physcomitrium patens 的配子叶透明。相比之下,烟草和托里尼亚中的雌蕊由于CS处理过程中的氧化而产生棕色色素。CSA通过防止氧化来减少棕色色素,并且可以使烟草和托里尼亚雌蕊透明,尽管这需要相对较长的时间(1或2个月)。CS和CSA还与使用化学染料的染色兼容,例如用于DNA的DAPI(4’,6-二氨基-2-苯基吲哚)和用于细胞壁的Hoechst 33342,以及用于细胞壁的Calcofluor White,SR2200和Direct Red 23。该方法可用于全植物成像,以揭示完整的形态,发育过程,植物 – 微生物相互作用和线虫感染。
细胞结构的可视化和蛋白质在生物体中的定位对于阐明它们在 体内的功能非常重要。然而,由于活体不透明,因此在不解剖的情况下观察活体的内部结构具有挑战性。特别是,在植物组织中,它们具有不同形状的细胞的多层,由其结构和吸光色素的存在引起的指数不匹配是有问题的。例如,植物叶子具有复杂的结构,使它们能够有效地利用进入体内的光进行光合作用1,而该结构也会导致折射率不匹配,使它们难以观察。然而,叶子有许多吸光色素,如叶绿素,它们会发出强烈的红色荧光,并且氧化会产生褐色色素2,3。这些色素也阻碍了植物中全安装荧光显微镜观察。因此,为了观察植物的内部结构,长期以来一直使用酒精脱色和固定以及使用水合氯醛清除,以消除折射率不匹配和自发荧光4,5。这些常规方法已经采用了很多年,但它们的缺点是同时消除了荧光蛋白的荧光6,7。这是有问题的,因为荧光蛋白在当前的荧光成像中已成为不可或缺的。
因此,ClearSee(CS)和ClearSeeAlpha(CSA)已被开发为植物组织的光学清除试剂。两种试剂均可降低叶绿素自发荧光,同时保持荧光蛋白的稳定性7,8。当由于组织氧化而产生棕色颜料时,CSA特别有用。使用这些清除试剂,可以在不进行物理切片的情况下观察植物体内的细胞结构和蛋白质定位。
这种方法包括固定,洗涤和清洁。固定是该协议中的关键步骤。如果在PFA固定后未观察到荧光蛋白,则在用清除溶液处理后不会观察到荧光蛋白。PFA溶液渗透到组织中至关重要,但不建议进行高真空处理,因为它会破坏细胞结构。应针对每种类型的组织和物种优化真空条件和固定期。建议即使在固定后也要检查荧光蛋白。虽然样品通常在室温下固定30-60分钟,但它们可以在4°C下固定更长的时间(过夜或更长时间)。
如图 6A所示,一些脱氧胆酸钠在溶解时呈淡黄色。这种脱氧胆酸钠溶液在380nm处激发后,在400-600nm区域显示出强烈的自发荧光(图6B)。这种自发荧光会阻止光学清除和荧光成像。用户应检查脱氧胆酸钠溶液的颜色,因为试剂的质量可能由于纯度,批次间变化或其他原因而有所不同。
这里使用的清除溶液含有高浓度的脱氧胆酸钠,这可能会破坏膜结构。即使在CS处理后也观察到质膜标志物(RPS5Apro::tdTomato-LTI6b)7。然而,根据感兴趣的结构和组织,降低脱氧胆酸钠的浓度可能更好。事实上,对于具有改性CS的 拟南芥 雌蕊,获得了具有更高清晰度的图像,其中脱氧胆酸钠的浓度降低了一半;然而,降低浓度的脱氧胆酸钠需要延长治疗时间(例如, 拟南芥 雌蕊花1个月)。
CS可以减少红色自发荧光(>610nm)以去除处理样品中的叶绿素。然而,即使在CS处理的样品中,500-600 nm范围的自发荧光(黄色至橙色)仍然存在7。这种自发荧光被认为来源于细胞壁和其他细胞成分,如木质素12,13。因此,通过CS处理很难使组织(例如具有发育的次级壁的茎)完全透明。
除了这里使用的那些之外,还开发了几种清除试剂,以使用荧光显微镜观察植物中的荧光蛋白14,15,16,17。与这些方法相比,CS和CSA去除叶绿素并减少自发荧光,使植物组织更加透明。最近,Sakamoto等人开发了一种改进的方法iTOMEI,用于固定,洗涤剂清除和安装以调整折射率不匹配18。在 拟南芥 幼苗中,iTOMEI在26小时内清除组织。
CS 适用于多种植物,如拟南芥、芫荠属7、苜蓿、黄瓜、桔梗、烟粉虱、芫荠属、芫荽荽20、鳄梨21、大麦 22、芸苔属 23、卡利特里奇24,桉树25,玉米26,Marchantia polymorpha27,Monophyllaea glabra28,Orobanche minor29,petunia30,rice31,Solanum lycopersicum32,soybean33,strawberry34,wheat35和Wolffiella hyalina36。对于较厚的组织,CS还可以使振动切片透明37,38。该方法允许研究植物中的细胞结构和基因表达模式37,38。此外,在CS处理的组织深处还观察到线虫感染20,39,真菌感染和共生19,40,41。因此,这种方法可用于从微观到宏观尺度的全组织成像,并有助于发现各种细胞,组织,器官和生物体之间的新相互作用。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了日本科学促进会(创新领域科学研究补助金(JP16H06464,JP16H06280至T.H.),科学研究补助金(B,JP17H03697至D.K.),挑战性探索性研究补助金(JP18K19331至D.K.),创新领域科学研究补助金(D.K.为JP20H05358)和日本科学技术厅(PRESTO计划(JPMJPR15QC至Y.M)的支持。 JPMJPR18K4 至 D.K.))。作者感谢名古屋大学转化生物分子研究所(WPI-ITbM)的现场成像中心支持微观研究和编辑(www.editage.com)进行英语编辑。
Calcofluor White | Sigma-Aldrich | F3543 | Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O |
ClearSee | 10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea | ||
Cover glass (18×18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
Cover glass (24×24 No.1) | MATSUNAMI | C024241 | |
Cover glass (25×60 No.1) | MATSUNAMI | C025601 | |
Desiccator | AS One | 1-5801-11 | |
Hoechst 33342 | DOJINDO | 346-07951 | 1 mg/mL in H2O |
Needle | TERUMO | NN-2238S | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
Silicone rubber sheet | AS One | 6-9085-12 | |
Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | Figure 6_1; Lot PSGYK-QB |
Sodium deoxycholate | Kishida Chemical | 260-71412 | Figure 6_2; Lot C05543H |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Figure 6_3; Lot SLBS7362 |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Figure 6_4; Lot BCBW0612 |
Sodium deoxycholate | Nacalai Tesque | 10712-96 | Figure 6_5; Lot M5R3403 |
Sodium deoxycholate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-08311 | Figure 6_6; Lot LKL0648 |
Sodium hydroxide | Nacalai Tesque | 31511-05 | |
Sodium sulphite | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-03411 | |
Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
Vacuum pump | BUCHI | V-700 | |
Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |