यहां, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की स्थिरता को बनाए रखते हुए पौधे के ऊतकों को पारदर्शी बनाने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। यह तकनीक भौतिक विभाजन के बिना साफ किए गए पौधे के ऊतकों की गहरी इमेजिंग की सुविधा प्रदान करती है।
माइक्रोस्कोप के तहत विच्छेदन के बिना, बहु-स्तरित और अपारदर्शी पौधे के नमूनों की आंतरिक संरचना का सीधे निरीक्षण करना चुनौतीपूर्ण है। इसके अलावा, क्लोरोफिल के लिए जिम्मेदार ऑटोफ्लोरेसेंस पौधों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अवलोकन में बाधा डालता है। लंबे समय से, पौधों को पारदर्शी बनाने के लिए विभिन्न समाशोधन अभिकर्मकों का उपयोग किया गया है। हालांकि, पारंपरिक समाशोधन अभिकर्मक फ्लोरोसेंट संकेतों को कम करते हैं; इसलिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ सेलुलर और इंट्रासेल्युलर संरचनाओं का निरीक्षण करना संभव नहीं है। अभिकर्मकों को विकसित किया गया था जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन स्थिरता को बनाए रखते हुए क्लोरोफिल को हटाकर पौधे के ऊतकों को साफ कर सकते हैं। समाशोधन अभिकर्मकों, ClearSee (CS) या ClearSeeAlpha (CSA) का उपयोग करके पौधे के ऊतकों के ऑप्टिकल समाशोधन के लिए यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। साफ किए गए पौधे के ऊतकों की तैयारी में तीन चरण शामिल हैं: निर्धारण, धोना और समाशोधन। निर्धारण सेलुलर संरचनाओं और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की इंट्रासेल्युलर स्थिरता को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण कदम है। समाशोधन के लिए इनक्यूबेशन समय ऊतक प्रकार और प्रजातियों पर निर्भर करता है। Arabidopsis thaliana में, सीएस के साथ समाशोधन के लिए आवश्यक समय पत्तियों और जड़ों के लिए 4 दिन, रोपाई के लिए 7 दिन, और pistils के लिए 1 महीने था। सीएस को 4 दिनों के अपेक्षाकृत कम समय की भी आवश्यकता होती है ताकि Physcomitrium patens के गैमेटोफाइटिक पत्तियों को पारदर्शी बनाया जा सके। इसके विपरीत, तंबाकू और टोरेनिया में पिस्टिल्स ने सीएस उपचार के दौरान ऑक्सीकरण के कारण भूरे रंग के वर्णक का उत्पादन किया। सीएसए ने ऑक्सीकरण को रोककर भूरे रंग के वर्णक को कम कर दिया और तंबाकू और टोरेनिया पिस्टिल्स को पारदर्शी बना सकता है, हालांकि इसमें अपेक्षाकृत लंबा समय (1 या 2 महीने) लगा। सीएस और सीएसए भी रासायनिक रंगों का उपयोग करके धुंधला करने के साथ संगत थे, जैसे कि डीएपीआई (4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल) और डीएनए और कैलकोफ्लोर व्हाइट के लिए होचस्ट 33342, एसआर 2200, और सेल की दीवार के लिए डायरेक्ट रेड 23। यह विधि पूरे पौधे इमेजिंग के लिए उपयोगी हो सकती है ताकि बरकरार आकृति विज्ञान, विकास प्रक्रियाओं, पौधे-माइक्रोब इंटरैक्शन और नेमाटोड संक्रमण को प्रकट किया जा सके।
सेलुलर संरचनाओं का विज़ुअलाइज़ेशन और जीवित जीवों में प्रोटीन का स्थानीयकरण विवो में उनके कार्यों को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, चूंकि जीवित शरीर पारदर्शी नहीं है, इसलिए विच्छेदन के बिना जीवित जीवों की आंतरिक संरचना का निरीक्षण करना चुनौतीपूर्ण है। विशेष रूप से, पौधे के ऊतकों के मामले में, जो विभिन्न आकारों की कोशिकाओं के साथ बहु-स्तरित होते हैं, उनकी संरचना और प्रकाश-अवशोषित वर्णकों की उपस्थिति के कारण सूचकांक बेमेल समस्याग्रस्त है। उदाहरण के लिए, पौधे की पत्तियों में एक जटिल संरचना होती है जो उन्हें प्रकाश संश्लेषण के लिए उनके शरीर में प्रवेश करने वाले प्रकाश का कुशलतापूर्वक उपयोग करने की अनुमति देती है1, जबकि संरचना अपवर्तक सूचकांक बेमेल का कारण भी बनती है, जिससे उन्हें निरीक्षण करना मुश्किल हो जाता है। हालांकि, पत्तियों में कई प्रकाश-अवशोषित वर्णक होते हैं, जैसे कि क्लोरोफिल, जो मजबूत लाल प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करते हैं और भूरे रंग के पिगमेंट ऑक्सीकरण 2,3 द्वारा उत्पादित होते हैं। ये पिगमेंट पौधों में पूरे-माउंट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी टिप्पणियों में भी बाधा डालते हैं। इसलिए, पौधों की आंतरिक संरचना का निरीक्षण करने के लिए, अल्कोहल द्वारा डिकॉलोराइजेशन और फिक्सेशन और क्लोरल हाइड्रेट का उपयोग करके समाशोधन का उपयोग अपवर्तक सूचकांक बेमेल और ऑटोफ्लोरेसेंस 4,5 को खत्म करने के लिए लंबे समय से किया गया है। इन पारंपरिक तरीकों को कई वर्षों से अपनाया गया है, लेकिन उनके पास एक ही समय में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के प्रतिदीप्ति को समाप्त करने का दोष है6,7। यह समस्याग्रस्त है क्योंकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन वर्तमान फ्लोरोसेंट इमेजिंग में अपरिहार्य हो गए हैं।
इसलिए, ClearSee (CS) और ClearSeeAlpha (CSA) को पौधे के ऊतकों के लिए ऑप्टिकल समाशोधन अभिकर्मकों के रूप में विकसित किया गया है। दोनों अभिकर्मक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की स्थिरता को बनाए रखते हुए क्लोरोफिल ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करते हैं7,8। सीएसए विशेष रूप से उपयोगी होता है जब ऊतक ऑक्सीकरण के कारण भूरे रंग के पिगमेंट का उत्पादन होता है। इन समाशोधन अभिकर्मकों का उपयोग करके, भौतिक विभाजन के बिना पौधे के शरीर के अंदर सेलुलर संरचना और प्रोटीन स्थानीयकरण का निरीक्षण करना संभव है।
इस विधि में निर्धारण, धोने और सफाई शामिल है। निर्धारण इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है। यदि पीएफए निर्धारण के बाद फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पालन नहीं किया जाता है, तो इसे समाशोधन समाधान के साथ उपचार के बाद नहीं देखा जाएगा। ऊतकों में पीएफए समाधान का प्रवेश महत्वपूर्ण है, लेकिन उच्च वैक्यूम उपचार की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि यह सेल संरचना को नष्ट कर सकता है। वैक्यूम की स्थिति और निर्धारण अवधि को प्रत्येक प्रकार के ऊतकों और प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। निर्धारण के बाद भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की जांच करने की सिफारिश की जाती है। हालांकि नमूने आमतौर पर कमरे के तापमान पर 30-60 मिनट के लिए तय किए गए थे, उन्हें लंबे समय तक (रात भर या अधिक) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर तय किया जा सकता है।
जैसा कि चित्र 6 ए में दिखाया गया है, कुछ सोडियम डीऑक्सीकोलेट्स में भंग होने पर एक पीला-पीला रंग था। इस तरह के सोडियम डीऑक्सीकोलेट समाधानों ने 380 एनएम (चित्रा 6 बी) पर उत्तेजना के बाद 400-600 एनएम क्षेत्र में मजबूत ऑटोफ्लोरेसेंस दिखाया। यह autofluorescence ऑप्टिकल समाशोधन और प्रतिदीप्ति इमेजिंग को रोकता है। उपयोगकर्ताओं को सोडियम डीऑक्सीकोलेट समाधान के रंग की जांच करनी चाहिए क्योंकि अभिकर्मक की गुणवत्ता शुद्धता, बहुत-से-बहुत भिन्नता, या अन्य कारणों से भिन्न हो सकती है।
यहां उपयोग किए जाने वाले समाशोधन समाधानों में सोडियम डीऑक्सीकोलेट की उच्च सांद्रता होती है, जो झिल्ली संरचना को नष्ट कर सकती है। प्लाज्मा झिल्ली मार्कर (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) सीएस उपचार 7 के बाद भी मनाया गया था। हालांकि, ब्याज की संरचना और ऊतक के आधार पर सोडियम डीऑक्सीकोलेट की एकाग्रता को कम करना बेहतर हो सकता है। दरअसल, संशोधित सीएस के साथ Arabidopsis pistils के लिए बेहतर स्पष्टता के साथ छवियों को प्राप्त किया गया था, जिसमें सोडियम डीऑक्सीकोलेट की एकाग्रता आधे से कम हो जाती है; हालांकि, सोडियम डीऑक्सीकोलेट की कम सांद्रता को लंबे समय तक उपचार के समय की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, Arabidopsis pistils के लिए 1 महीना)।
सीएस उपचारित नमूनों में क्लोरोफिल को हटाने के लिए लाल ऑटोफ्लोरेसेंस (>610 एनएम) को कम कर सकता है। हालांकि, 500-600 एनएम रेंज ऑटोफ्लोरेसेंस (पीले से नारंगी) सीएस-उपचारित नमूनों में भी बने रहे। माना जाता है कि यह ऑटोफ्लोरेसेंस सेल की दीवार और अन्य सेलुलर घटकों से व्युत्पन्न है, जैसे कि लिग्निन 12,13। इसलिए, ऊतकों को बनाना मुश्किल है, जैसे कि विकसित माध्यमिक दीवारों के साथ उपजी, सीएस उपचार द्वारा पूरी तरह से पारदर्शी।
फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी 14,15,16,17 का उपयोग करके पौधों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का निरीक्षण करने के लिए यहां उपयोग किए जाने वाले लोगों के अलावा कई समाशोधन अभिकर्मकों को विकसित किया गया है। इन तरीकों की तुलना में, सीएस और सीएसए क्लोरोफिल को हटा देते हैं और ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करते हैं, जिससे पौधे के ऊतक अधिक पारदर्शी हो जाते हैं। हाल ही में, सकामोटो एट अल ने एक बेहतर विधि, iTOMEI, निर्धारण, डिटर्जेंट समाशोधन और अपवर्तक सूचकांक बेमेल 18 को समायोजित करने के लिए बढ़ते के लिए विकसित की। Arabidopsis रोपाई में, iTOMEI ने 26 घंटे के भीतर ऊतक को साफ कर दिया।
सीएस पौधों की प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होता है, जैसे कि Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, avocado21, barley22, Brasica rapa23, Callitriche 24, नीलगिरी 25, मक्का 26, Marchantia polymorpha27, Monophyllaea glabra28, Orobanche minor29, petunia30, rice31, Solanum lycopersicum32, सोयाबीन 33, स्ट्रॉबेरी 34, wheat35, और Wolffiella hyalina36. मोटे ऊतकों के लिए, सीएस भी वाइब्रेटोम वर्गों को पारदर्शी 37,38 बना सकता है। इस विधि ने पौधों में सेलुलर संरचना और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के अध्ययन की अनुमति दी37,38। इसके अलावा, नेमाटोड संक्रमण 20,39, फंगल संक्रमण, और सहजीवन 19,40,41 भी सीएस-उपचारित ऊतकों के अंदर गहराई से देखे गए थे। इस प्रकार, यह विधि माइक्रो से मैक्रो-स्केल तक पूरे ऊतक इमेजिंग के लिए उपयोगी है और विभिन्न कोशिकाओं, ऊतकों, अंगों और जीवों के बीच उपन्यास इंटरैक्शन की खोज करने में मदद कर सकती है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-इन-एड (JP16H06464, JP16H06280 से T.H.), वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-इन-एड (B, JP17H03697 से D.K.), चुनौतीपूर्ण अन्वेषणात्मक अनुसंधान के लिए अनुदान-इन-एड (JP18K19331 से D.K.), वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-इन-एड (JP18K19331 से D.K.), वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-इन-एड (JP18K19331 से D.K.), वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-इन-एड (JP18K19331) द्वारा समर्थित किया गया था.M। JPMJPR18K4 से D.K.)) लेखक अंग्रेजी भाषा संपादन के लिए सूक्ष्म अध्ययन और संपादन (www.editage.com) का समर्थन करने के लिए नागोया विश्वविद्यालय के इंस्टीट्यूट ऑफ ट्रांसफॉर्मेटिव बायो-मॉलिक्यूल्स (डब्ल्यूपीआई-आईटीबीएम) में लाइव इमेजिंग सेंटर के आभारी हैं।
Calcofluor White | Sigma-Aldrich | F3543 | Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O |
ClearSee | 10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea | ||
Cover glass (18×18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
Cover glass (24×24 No.1) | MATSUNAMI | C024241 | |
Cover glass (25×60 No.1) | MATSUNAMI | C025601 | |
Desiccator | AS One | 1-5801-11 | |
Hoechst 33342 | DOJINDO | 346-07951 | 1 mg/mL in H2O |
Needle | TERUMO | NN-2238S | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
Silicone rubber sheet | AS One | 6-9085-12 | |
Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | Figure 6_1; Lot PSGYK-QB |
Sodium deoxycholate | Kishida Chemical | 260-71412 | Figure 6_2; Lot C05543H |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Figure 6_3; Lot SLBS7362 |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Figure 6_4; Lot BCBW0612 |
Sodium deoxycholate | Nacalai Tesque | 10712-96 | Figure 6_5; Lot M5R3403 |
Sodium deoxycholate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-08311 | Figure 6_6; Lot LKL0648 |
Sodium hydroxide | Nacalai Tesque | 31511-05 | |
Sodium sulphite | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-03411 | |
Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
Vacuum pump | BUCHI | V-700 | |
Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |