여기에서는 형광 단백질의 안정성을 유지하면서 식물 조직을 투명하게 만드는 방법에 대해 설명한다. 이 기술은 물리적 단면화없이 제거 된 식물 조직의 깊은 이미징을 용이하게합니다.
해부없이 현미경으로 다층 및 불투명 한 식물 표본의 내부 구조를 직접 관찰하는 것은 어렵습니다. 또한, 엽록소에 의한 자가형광은 식물에서 형광 단백질의 관찰을 방해한다. 오랫동안 식물을 투명하게 만들기 위해 다양한 청산 시약이 사용되어 왔습니다. 그러나, 종래의 클리어링 시약은 형광 신호를 감소시킨다; 따라서, 형광 단백질로 세포 및 세포내 구조를 관찰하는 것은 불가능하였다. 형광 단백질 안정성을 유지하면서 엽록소를 제거하여 식물 조직을 맑게 할 수 있는 시약이 개발되었다. 클리어링 시약, ClearSee (CS) 또는 ClearSeeAlpha (CSA)를 사용하여 식물 조직의 광학 클리어링을 위해 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 제거 된 식물 조직의 준비에는 고정, 세척 및 청산의 세 단계가 포함됩니다. 고정은 형광 단백질의 세포 구조 및 세포 내 안정성을 유지하는 데 중요한 단계입니다. 클리어링을 위한 인큐베이션 시간은 조직 유형 및 종에 따라 달라진다. 애기장대에서 CS로 개간하는 데 필요한 시간은 잎과 뿌리의 경우 4 일, 묘목의 경우 7 일, 피스틸의 경우 1 개월이었습니다. CS는 또한 Physcomitrium patens 의 gametophytic 잎을 투명하게 만들기 위해 4 일의 비교적 짧은 시간이 필요했습니다. 대조적으로, 담배와 토레니아의 피스틸은 CS 처리 동안 산화로 인해 갈색 색소를 생성했습니다. CSA는 산화를 방지하여 갈색 색소를 감소시키고 담배와 토레니아 피스틸을 투명하게 만들 수 있었지만 비교적 오랜 시간 (1 ~ 2 개월)이 걸렸습니다. CS 및 CSA는 또한 DNA 및 세포벽에 대한 칼코플루오르 화이트, SR2200 및 다이렉트 레드 23에 대한 DAPI (4′,6-디아미디노-2-페닐인돌) 및 Hoechst 33342와 같은 화학 염료를 사용한 염색과 상용성이었다. 이 방법은 온전한 형태학, 발달 과정, 식물 – 미생물 상호 작용 및 선충류 감염을 드러내기 위해 전체 식물 이미징에 유용 할 수 있습니다.
세포 구조의 시각화와 살아있는 유기체에서 단백질의 국소화는 생체 내에서 그들의 기능을 명확히하는 데 중요합니다. 그러나 생체가 투명하지 않기 때문에 해부없이 살아있는 유기체의 내부 구조를 관찰하는 것은 어렵습니다. 특히, 다른 모양의 세포로 다층화 된 식물 조직의 경우, 그 구조와 광흡수 안료의 존재로 인한 지수 불일치가 문제가됩니다. 예를 들어, 식물 잎은 광합성을 위해 몸에 들어오는 빛을 효율적으로 활용할 수있는 복잡한 구조를 가지고 있지만1 구조는 굴절률 불일치를 일으켜 관찰하기 어렵게 만듭니다. 그러나 잎에는 엽록소와 같은 많은 광흡수 안료가 있는데, 이는 강한 적색 형광을 방출하고 갈색 안료는 산화에 의해 생성된다2,3. 이 안료는 또한 식물에서 전체 마운트 형광 현미경 관찰을 방해합니다. 따라서, 식물의 내부 구조를 관찰하기 위해, 알코올에 의한 탈색 및 고정과 클로랄 하이드레이트를 이용한 클리어링은 굴절률 불일치 및 자가형광을 제거하기 위해 오랫동안 사용되어 왔다4,5. 이러한 종래의 방법들은 수년 동안 채택되어 왔지만, 형광 단백질의 형광을 동시에 제거하는 단점을 가지고 있다6,7. 이것은 형광 단백질이 현재의 형광 영상화에서 없어서는 안될 필수 요소가되기 때문에 문제가됩니다.
따라서 ClearSee (CS) 및 ClearSeeAlpha (CSA)는 식물 조직을위한 광학 클리어링 시약으로 개발되었습니다. 두 시약 모두 형광 단백질의 안정성을 유지하면서 엽록소 자가형광을 감소시킨다7,8. CSA는 조직 산화로 인해 갈색 안료가 생성될 때 특히 유용하다. 이러한 클리어링 시약을 사용하여, 물리적 절편화 없이 식물체 내부의 세포 구조 및 단백질 국재화를 관찰할 수 있다.
이 방법은 고정, 세척 및 청소로 구성됩니다. 고정은이 프로토콜에서 중요한 단계입니다. PFA 고정 후 형광 단백질이 관찰되지 않으면 클리어링 용액으로 처리 한 후에는 관찰되지 않습니다. PFA 용액이 조직으로 침투하는 것은 중요하지만 세포 구조를 파괴 할 수 있기 때문에 고진공 처리는 권장되지 않습니다. 진공 조건 및 고정 기간은 각 유형의 조직 및 종에 대해 최적화되어야합니다. 고정 후에도 형광 단백질을 확인하는 것이 좋습니다. 샘플은 보통 실온에서 30-60분 동안 고정되었지만, 이들은 더 긴 시간(하룻밤 또는 그 이상) 동안 4°C에서 고정될 수 있다.
도 6A에 도시된 바와 같이, 일부 소듐 데옥시콜레이트는 용해되었을 때 옅은 황색을 가졌다. 이러한 소듐 데옥시콜레이트 용액은 380 nm에서 여기 후 400-600 nm 영역에서 강한 자가형광을 보였다(도 6B). 이 자동 형광은 광학 클리어링 및 형광 이미징을 방지합니다. 사용자는 시약의 품질이 순도, 로트 투 로트 변동 또는 기타 이유로 인해 다를 수 있으므로 나트륨 데옥시콜레이트 용액의 색상을 확인해야합니다.
여기에 사용 된 클리어링 용액은 고농도의 데옥시 콜레이트 나트륨을 가지고있어 막 구조를 파괴 할 수 있습니다. 원형질막 마커(RPS5Apro::tdTomato-LTI6b)는 CS 처리7 후에도 관찰되었다. 그러나 관심있는 구조와 조직에 따라 데옥시콜레이트 나트륨의 농도를 줄이는 것이 더 나을 수 있습니다. 실제로, 개선된 선명도를 갖는 이미지들이 변형된 CS를 갖는 애기장대 피스틸에 대해 얻어졌으며, 여기서 나트륨 데옥시콜레이트의 농도는 절반으로 감소된다; 그러나, 나트륨 데옥시콜레이트의 감소된 농도는 연장된 치료 시간(예를 들어, 애기장대 피스틸의 경우 1개월)을 필요로 하였다.
CS는 처리된 샘플에서 엽록소를 제거하기 위해 적색 자가형광(>610nm)을 감소시킬 수 있다. 그러나, 500-600 nm 범위의 자가형광(황색 내지 주황색)은 CS 처리된 샘플에서도 남아있었다7. 이러한 자가형광은 세포벽 및 다른 세포 성분, 예컨대 lignin12,13으로부터 유래된 것으로 생각된다. 따라서, 이차벽이 발달된 줄기와 같은 조직을 CS 처리에 의해 완전히 투명하게 만드는 것은 어렵다.
여기에 사용된 것 외에 몇몇 클리어링 시약은 형광 현미경14,15,16,17을 사용하여 식물에서 형광 단백질을 관찰하기 위해 개발되었다. 이러한 방법과 비교하여 CS와 CSA는 엽록소를 제거하고 자기 형광을 감소시켜 식물 조직을보다 투명하게 만듭니다. 최근 Sakamoto 등은 굴절률 불일치를 조정하기 위해 고정, 세제 제거 및 장착을위한 개선 된 방법 인 iTOMEI를 개발했습니다.18. 애기장대 묘목에서 iTOMEI는 26 시간 이내에 조직을 제거했습니다.
CS는 애기장대 탈리아나, 피스코미트리움 파텐스7, 국화 모리폴리움, 쿠쿠미스 사티부스, 니코티아나 벤타미아나, 니코티아나 타바쿰, 토레니아 포니에리8, 알륨 오코텐세19, 황기 시니쿠스20, 아보카도21, 보리22, 브라시카 라파23, 칼리트리체와 같은 광범위한 식물 종에 적용 가능합니다. 24, 유칼립투스25, 옥수수26, 마르칸티아 다형체27, 모노필레아 글라브라28, 오로반체 마이너29, 페투니아30, 쌀31, 솔라눔 리코페르시쿰32, 대두33, 딸기34, 밀35, 울프피엘라 히알리나36. 더 두꺼운 조직의 경우, CS는 또한 vibratome 섹션을 투명하게 만들 수 있습니다37,38. 이 방법은 식물에서 세포 구조 및 유전자 발현 패턴에 대한 연구를 허용했다37,38. 더욱이, 선충류 감염20,39, 진균 감염, 및 공생19,40,41도 CS 처리된 조직 내부 깊숙이 관찰되었다. 따라서, 이 방법은 마이크로-스케일에서 매크로-스케일에 이르는 전체 조직 이미징에 유용하며, 다양한 세포, 조직, 기관 및 유기체 사이의 새로운 상호작용을 발견하는 데 도움이 될 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 일본 과학 진흥 협회 (혁신 분야에 대한 과학 연구 보조금 (JP16H06464, JP16H06280 ~ T.H.), 과학 연구 보조금 (B, JP17H03697 ~ D.K.), 도전적인 탐구 연구를위한 보조금 (JP18K19331 ~ D.K.), 혁신 분야에 대한 과학 연구 보조금 (D.K.의 경우 JP20H05358)) 및 일본 과학 기술국 (PRESTO 프로그램 (JPMJPR15QC에서 Y.M, JPMJPR18K4 내지 D.K.)). 저자들은 나고야 대학의 변형 생체 분자 연구소 (WPI-ITbM)의 라이브 이미징 센터 (Live Imaging Center)가 영어 편집을위한 현미경 연구 및 편집 (www.editage.com)을 지원해 준 것에 감사드립니다.
Calcofluor White | Sigma-Aldrich | F3543 | Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O |
ClearSee | 10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea | ||
Cover glass (18×18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
Cover glass (24×24 No.1) | MATSUNAMI | C024241 | |
Cover glass (25×60 No.1) | MATSUNAMI | C025601 | |
Desiccator | AS One | 1-5801-11 | |
Hoechst 33342 | DOJINDO | 346-07951 | 1 mg/mL in H2O |
Needle | TERUMO | NN-2238S | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
Silicone rubber sheet | AS One | 6-9085-12 | |
Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | Figure 6_1; Lot PSGYK-QB |
Sodium deoxycholate | Kishida Chemical | 260-71412 | Figure 6_2; Lot C05543H |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Figure 6_3; Lot SLBS7362 |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Figure 6_4; Lot BCBW0612 |
Sodium deoxycholate | Nacalai Tesque | 10712-96 | Figure 6_5; Lot M5R3403 |
Sodium deoxycholate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-08311 | Figure 6_6; Lot LKL0648 |
Sodium hydroxide | Nacalai Tesque | 31511-05 | |
Sodium sulphite | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-03411 | |
Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
Vacuum pump | BUCHI | V-700 | |
Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |