Burada, floresan proteinlerinin stabilitesini korurken bitki dokularını şeffaf hale getirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, temizlenmiş bitki dokularının fiziksel kesitleme olmadan derin görüntülenmesini kolaylaştırır.
Çok katmanlı ve opak bitki örneklerinin iç yapısını, diseksiyon olmadan, mikroskop altında doğrudan gözlemlemek zordur. Ek olarak, klorofil’e atfedilen otofloresan, bitkilerde floresan proteinlerinin gözlemlenmesini engeller. Uzun süredir, bitkileri şeffaf hale getirmek için çeşitli temizleme reaktifleri kullanılmıştır. Bununla birlikte, geleneksel temizleme reaktifleri floresan sinyallerini azaltır; bu nedenle floresan proteinlerle hücresel ve hücre içi yapıları gözlemlemek mümkün olmamıştır. Floresan protein stabilitesini korurken klorofil gidererek bitki dokularını temizleyebilen reaktifler geliştirilmiştir. Burada, temizleme reaktifleri, ClearSee (CS) veya ClearSeeAlpha (CSA) kullanılarak bitki dokularının optik olarak temizlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Temizlenmiş bitki dokularının hazırlanması üç adımdan oluşur: fiksasyon, yıkama ve temizleme. Fiksasyon, floresan proteinlerin hücresel yapılarını ve hücre içi stabilitesini korumada çok önemli bir adımdır. Temizleme için kuluçka süresi doku tipine ve türüne bağlıdır. Arabidopsis thaliana’da, CS ile temizlik için gereken süre yapraklar ve kökler için 4 gün, fideler için 7 gün ve pistiller için 1 aydı. CS ayrıca Physcomitrium patens’in gametofitik yapraklarını şeffaf hale getirmek için nispeten kısa bir süre 4 gün gerektirdi. Buna karşılık, tütün ve toreniadaki pistiller, CS tedavisi sırasında oksidasyona bağlı olarak kahverengi pigment üretti. CSA, oksidasyonu önleyerek kahverengi pigmenti azalttı ve nispeten uzun bir süre (1 veya 2 ay) sürmesine rağmen, tütün ve torenia pistillerini şeffaf hale getirebilir. CS ve CSA, DNA için DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) ve Hoechst 33342 ve hücre duvarı için Calcofluor White, SR2200 ve Direct Red 23 gibi kimyasal boyalar kullanılarak boyama ile de uyumluydu. Bu yöntem, bozulmamış morfolojiyi, gelişimsel süreçleri, bitki-mikrop etkileşimlerini ve nematod enfeksiyonlarını ortaya çıkarmak için tüm bitki görüntülemesi için yararlı olabilir.
Canlı organizmalarda hücresel yapıların görselleştirilmesi ve proteinlerin lokalizasyonu, fonksiyonlarının in vivo olarak açıklığa kavuşturulması açısından önemlidir. Bununla birlikte, canlı vücudu şeffaf olmadığından, canlı organizmaların iç yapısını diseksiyon olmadan gözlemlemek zordur. Özellikle farklı şekillerdeki hücrelerle çok katmanlı olan bitki dokularında, yapılarından ve ışık emici pigmentlerin varlığından kaynaklanan indeks uyumsuzluğu sorunludur. Örneğin, bitki yaprakları, fotosentez için vücutlarına giren ışığı verimli bir şekilde kullanmalarını sağlayan karmaşık bir yapıya sahiptir1, oysa yapı aynı zamanda kırılma indisi uyumsuzluğuna neden olur ve bu da onları gözlemlemeyi zorlaştırır. Bununla birlikte, yapraklar klorofil gibi güçlü kırmızı floresan yayan birçok ışık emici pigmente sahiptir ve oksidasyonla kahverengimsi pigmentler üretilir2,3. Bu pigmentler ayrıca bitkilerde tam montajlı floresan mikroskopi gözlemlerini de engeller. Bu nedenle, bitkilerin iç yapısını gözlemlemek için, alkol ile renk giderme ve sabitleme ve kloral hidrat kullanarak temizleme, kırılma indisi uyumsuzluğunu ve otofloresansı ortadan kaldırmak için uzun süredir kullanılmaktadır4,5. Bu geleneksel yöntemler uzun yıllardır benimsenmiştir, ancak floresan proteinlerinin floresansını aynı anda ortadan kaldırma dezavantajına sahiptir6,7. Floresan proteinler mevcut floresan görüntülemede vazgeçilmez hale geldiği için bu sorunludur.
Bu nedenle, ClearSee (CS) ve ClearSeeAlpha (CSA), bitki dokuları için optik temizleme reaktifleri olarak geliştirilmiştir. Her iki reaktif de floresan proteinlerinin stabilitesini korurken klorofil otofloresansını azaltır7,8. CSA, doku oksidasyonu nedeniyle kahverengi pigmentler üretildiğinde özellikle yararlıdır. Bu temizleme reaktiflerini kullanarak, fiziksel kesitleme olmadan bitki gövdesi içindeki hücresel yapıyı ve protein lokalizasyonunu gözlemlemek mümkündür.
Bu yöntem sabitleme, yıkama ve temizlemeden oluşur. Fiksasyon, bu protokolde kritik bir adımdır. PFA fiksasyonundan sonra floresan protein gözlenmezse, temizleme çözeltisi ile işlemden sonra gözlenmeyecektir. PFA çözeltisinin dokulara nüfuz etmesi kritiktir, ancak hücre yapısını tahrip edebileceğinden yüksek vakum tedavisi önerilmez. Vakum koşulları ve fiksasyon süreleri, her doku ve tür türü için optimize edilmelidir. Fiksasyondan sonra bile floresan proteinlerinin kontrol edilmesi önerilir. Numuneler genellikle oda sıcaklığında 30-60 dakika sabitlenmiş olsa da, 4 ° C’de daha uzun süre (gece veya daha fazla) sabitlenebilirler.
Şekil 6A’da gösterildiği gibi, bazı sodyum deoksikolatlar çözündüğünde soluk sarı bir renge sahipti. Bu tür sodyum deoksikolat çözeltileri, 380 nm’de uyarıldıktan sonra 400-600 nm bölgesinde güçlü otofloresan göstermiştir (Şekil 6B). Bu otofloresan, optik temizlemeyi ve floresan görüntülemeyi önler. Kullanıcılar sodyum deoksikolat çözeltisinin rengini kontrol etmelidir, çünkü reaktifin kalitesi saflık, lot-lot varyasyonu veya diğer nedenlerden dolayı farklılık gösterebilir.
Burada kullanılan temizleme çözeltileri, membran yapısını tahrip edebilecek yüksek konsantrasyonlarda sodyum deoksikolata sahiptir. Plazma membran belirteci (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) CS tedavisinden sonra bile gözlendi7. Bununla birlikte, ilgilenilen yapıya ve dokuya bağlı olarak sodyum deoksikolat konsantrasyonunu azaltmak daha iyi olabilir. Gerçekten de, sodyum deoksikolat konsantrasyonunun yarı yarıya azaldığı modifiye CS’li Arabidopsis pistilleri için daha net görüntüler elde edildi; Bununla birlikte, sodyum deoksikolat konsantrasyonlarının azalması uzun tedavi süreleri gerektiriyordu (örneğin, Arabidopsis pistilleri için 1 ay).
CS, işlenmiş numunelerde klorofili gidermek için kırmızı otofloresanı (>610 nm) azaltabilir. Bununla birlikte, CS ile işlenmiş numunelerde bile 500-600 nm aralığında otofloresan (sarıdan turuncuya) kalmıştır7. Bu otofloresanın hücre duvarından ve lignin12,13 gibi diğer hücresel bileşenlerden türetildiği düşünülmektedir. Bu nedenle, gelişmiş ikincil duvarlara sahip saplar gibi dokuların CS tedavisi ile tamamen şeffaf hale getirilmesi zordur.
Burada kullanılanların yanı sıra floresan mikroskopi kullanılarak bitkilerde floresan proteinleri gözlemlemek için çeşitli temizleme reaktifleri geliştirilmiştir14,15,16,17. Bu yöntemlerle karşılaştırıldığında, CS ve CSA klorofili uzaklaştırır ve otofloresansı azaltarak bitki dokularını daha şeffaf hale getirir. Son zamanlarda, Sakamoto ve ark. fiksasyon, deterjan temizleme ve kırılma indisi uyumsuzluğunu ayarlamak için montaj için geliştirilmiş bir yöntem olan iTOMEI’yi geliştirdiler18. Arabidopsis fidelerinde, iTOMEI dokuyu 26 saat içinde temizledi.
CS, Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, avocado21, arpa22, Brassica rapa23, Callitriche gibi çok çeşitli bitki türlerine uygulanabilir. 24, Eucalyptus25, mısır26, Marchantia polymorpha27, Monophyllaea glabra28, Orobanche minor29, petunia30, pirinç31, Solanum lycopersicum32, soya fasulyesi33, çilek34, buğday35 ve Wolffiella hyalina36. Daha kalın dokular için, CS ayrıca vibratom bölümlerini saydam hale getirebilir37,38. Bu yöntem, bitkilerdeki hücresel yapı ve gen ekspresyon paternlerinin incelenmesine izin verdi37,38. Ayrıca, CS ile tedavi edilen dokuların derinliklerinde nematod enfeksiyonları20,39, mantar enfeksiyonları ve simbiyoz19,40,41 de gözlenmiştir. Bu nedenle, bu yöntem mikrodan makro ölçeklere kadar tüm doku görüntüleme için yararlıdır ve çeşitli hücreler, dokular, organlar ve organizmalar arasındaki yeni etkileşimlerin keşfedilmesine yardımcı olabilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği (Yenilikçi Alanlar Üzerine Bilimsel Araştırmalar için Hibe-in-Aid (JP16H06464, JP16H06280 – T.H.), Bilimsel Araştırma için Hibe-in-Aid (B, JP17H03697 – DC), Zorlu Keşif Araştırmaları için Yardım Hibesi (JP18K19331 – DC), Yenilikçi Alanlar Üzerine Bilimsel Araştırma için Hibe-in-Aid (DC için JP20H05358)) ve Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı (PRESTO programı (JPMJPR15QC to Y.M.) tarafından desteklenmiştir. JPMJPR18K4 ila D.K.)). Yazarlar, Nagoya Üniversitesi Dönüştürücü Biyo-Moleküller Enstitüsü’ndeki (WPI-ITbM) Canlı Görüntüleme Merkezi’ne, mikroskobik çalışmaları ve İngilizce dil düzenlemesi için Editage’ı (www.editage.com) destekledikleri için teşekkür eder.
Calcofluor White | Sigma-Aldrich | F3543 | Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O |
ClearSee | 10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea | ||
Cover glass (18×18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
Cover glass (24×24 No.1) | MATSUNAMI | C024241 | |
Cover glass (25×60 No.1) | MATSUNAMI | C025601 | |
Desiccator | AS One | 1-5801-11 | |
Hoechst 33342 | DOJINDO | 346-07951 | 1 mg/mL in H2O |
Needle | TERUMO | NN-2238S | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
Silicone rubber sheet | AS One | 6-9085-12 | |
Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | Figure 6_1; Lot PSGYK-QB |
Sodium deoxycholate | Kishida Chemical | 260-71412 | Figure 6_2; Lot C05543H |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Figure 6_3; Lot SLBS7362 |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Figure 6_4; Lot BCBW0612 |
Sodium deoxycholate | Nacalai Tesque | 10712-96 | Figure 6_5; Lot M5R3403 |
Sodium deoxycholate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-08311 | Figure 6_6; Lot LKL0648 |
Sodium hydroxide | Nacalai Tesque | 31511-05 | |
Sodium sulphite | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-03411 | |
Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
Vacuum pump | BUCHI | V-700 | |
Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |