Une méthode robuste pour la production à grande échelle de sphéroïdes pour les applications de criblage et d’analyse à haute teneur
Summary
Ce protocole détaille une méthode pour la production de trois types différents de sphéroïdes d’une manière qui les rend adaptés au criblage et à l’analyse à grande échelle à haute teneur. En outre, des exemples sont présentés montrant comment ils peuvent être analysés au niveau des sphéroïdes et des cellules individuelles.
Abstract
Le criblage à haute teneur (HCS) et l’analyse à haute teneur (HCA) sont des technologies qui permettent aux chercheurs d’extraire des mesures phénotypiques quantitatives à grande échelle des cellules. Cette approche s’est avérée puissante pour approfondir notre compréhension d’un large éventail d’événements fondamentaux et appliqués en biologie cellulaire. À ce jour, la majorité des applications de cette technologie reposent sur l’utilisation de cellules cultivées en monocouches, bien qu’il soit de plus en plus réalisé que de tels modèles ne récapitulent pas bon nombre des interactions et des processus qui se produisent dans les tissus. En tant que tel, il y a eu une émergence dans le développement et l’utilisation d’assemblages cellulaires en 3 dimensions (3D), tels que les sphéroïdes et les organoïdes. Bien que ces modèles 3D soient particulièrement puissants dans le contexte de la biologie du cancer et des études d’administration de médicaments, leur production et leur analyse d’une manière reproductible adaptée au HCS et au HCA présentent un certain nombre de défis. Le protocole détaillé ici décrit une méthode de génération de sphéroïdes tumoraux multicellulaires (MCTS) et démontre qu’il peut être appliqué à trois lignées cellulaires différentes d’une manière compatible avec HCS et HCA. La méthode facilite la production de plusieurs centaines de sphéroïdes par puits, offrant l’avantage spécifique que lorsqu’elles sont utilisées dans un régime de criblage, les données peuvent être obtenues à partir de plusieurs centaines de structures par puits, toutes traitées de manière identique. Des exemples sont également fournis, qui détaillent comment traiter les sphéroïdes pour l’imagerie par fluorescence à haute résolution et comment HCA peut extraire des caractéristiques quantitatives à la fois au niveau des sphéroïdes ainsi qu’à partir de cellules individuelles dans chaque sphéroïde. Ce protocole pourrait facilement être appliqué pour répondre à un large éventail de questions importantes en biologie cellulaire.
Introduction
Traditionnellement, les essais cellulaires ont été effectués dans des monocouches se développant sur un substrat solide, qui peut effectivement être considéré comme un environnement bidimensionnel (2D). Cependant, il est de plus en plus reconnu que les modèles de culture cellulaire 2D manquent de pertinence physiologique dans certains contextes et ne peuvent pas reproduire bon nombre des interactions complexes qui se produisent entre les cellules1. Les méthodes de culture cellulaire tridimensionnelle (3D) deviennent rapidement populaires parmi les chercheurs, et les modèles cellulaires 3D montrent un potentiel élevé pour mieux imiter les conditions physiologiques rencontrées par les cellules dans l’environnement tissulaire2. Il existe plusieurs types différents d’assemblages de cellules 3D qui ont été utilisés, mais les deux types les plus courants sont les sphéroïdes et les organoïdes. Les sphéroïdes peuvent être cultivés à partir de nombreuses lignées cellulaires différentes, et ils peuvent adopter différentes formes et tailles en fonction du type de cellule utilisé et de leur méthode d’assemblage3. De plus, les sphéroïdes peuvent également être appelés sphéroïdes tumoraux multicellulaires (SCTM) lorsqu’ils sont cultivés à partir de lignées cellulaires cancéreuses, et ces modèles ont trouvé une utilisation particulière pour l’administration préclinique de médicaments in vitro et les études de toxicité4,5. Les organoïdes, d’autre part, visent à mieux imiter les tissus et les organes de notre corps et peuvent adopter des arrangements morphologiques plus complexes. La production d’organoïdes implique l’utilisation de cellules souches adultes ou de cellules souches pluripotentes, qui peuvent être reprogrammées dans les cellules appropriées pour ressembler au tissu ou à l’organe d’intérêt. Ils sont principalement utilisés pour étudier le développement des organes et modéliser les maladies et les interactions hôte-pathogène6.
Il existe une gamme de méthodes différentes utilisées pour générer des assemblages de cellules 3D. Les méthodes basées sur l’échafaudage fournissent un substrat ou un support auquel les cellules peuvent s’attacher ou se développer à l’intérieur. Ces échafaudages peuvent avoir différentes formes et peuvent être fabriqués à partir d’une variété de matériaux différents. Les plus courants sont les composants de la matrice extracellulaire (ECM) et les hydrogels, et ils sont conçus pour ressembler à l’environnement extracellulaire naturel des cellules et faciliter ainsi les interactions physiologiques4,7. Le matériau du sous-sol ECM a été extrait de la tumeur du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm et il a été démontré qu’il contenait un riche mélange de composants ECM, y compris la laminine, le collagène de type IV et le perlécan8. Cependant, malgré sa composition avantageuse, son utilisation présente deux défis principaux, à savoir sa variabilité d’un lot à l’autre et le fait qu’il présente deux états agrégés différents inférieurs et supérieurs à 10 °C8,9. En revanche, les hydrogels ont l’avantage d’être flexibles en ce qui concerne leurs composants et leur rigidité, et ils peuvent être personnalisés pour s’adapter à l’assemblage de cellules 3D spécifique souhaité7,10. Les méthodes basées sur l’échafaudage sont essentielles pour la croissance organoïde, mais sont également largement utilisées pour les sphéroïdes. Les méthodes sans échafaudage, qui fonctionnent en empêchant les cellules de se fixer à la surface sur laquelle elles poussent, ne sont généralement compatibles qu’avec l’assemblage sphéroïde. Les exemples incluent des plaques à fixation ultra-faible (ULA), avec un fond plat ou un fond en U, qui permettent l’agrégation des cellules en sphéroïdes, ou l’utilisation d’une agitation continue des cellules dans des flacons de rotation10.
L’utilisation d’assemblages de cellules 3D pour étudier une grande variété d’événements biologiques gagne rapidement en popularité; toutefois, il est essentiel que la méthode choisie pour leur culture soit appropriée et compatible avec les plans d’analyse en aval. Par exemple, l’utilisation de plaques ULA génère des sphéroïdes de haute consistance; cependant, cette méthode est limitée à la production d’un seul sphéroïde par puits, limitant ainsi le débit. Une attention particulière est nécessaire lors de la planification de l’imagerie par fluorescence de la structure 3D. Le substrat ou la plaque sur lequel l’assemblage est cultivé doit être optiquement compatible et il faut veiller à minimiser les effets de la diffusion de la lumière causés par les échafaudages qui ont pu être utilisés11. Ce problème particulier devient plus aigu à mesure que l’ouverture numérique des lentilles de l’objectif du microscope augmente.
On peut soutenir que l’une des principales raisons de choisir de travailler avec un modèle de cellule 3D est d’extraire des données d’imagerie volumétrique non seulement sur l’ensemble de l’assemblage, mais aussi sur les cellules individuelles qu’il contient. Les modèles MCTS, en particulier, commencent à s’avérer très puissants pour approfondir notre compréhension de la façon dont les thérapies transitent de l’extérieur vers les cellules centrales (comme elles en auraient besoin dans une tumeur)12, et il est donc essentiel d’acquérir des connaissances à partir de cellules individuelles à différentes couches. La technologie d’imagerie qui extrait des informations quantitatives de cellules individuelles est appelée analyse à haute teneur (HCA) et constitue une approche puissante dans le contexte du dépistage13. À ce jour, le HCA a été presque exclusivement appliqué aux cultures monocouches, mais on se rend de plus en plus compte que cette approche a le pouvoir d’être appliquée aux cultures 3D permettant d’étudier un large éventail de fonctions et de processus cellulaires14. Il aurait l’avantage évident qu’un grand nombre d’assemblages 3D pourraient être analysés, fournissant potentiellement des données au niveau de la cellule de chaque structure. Cependant, les défis associés à l’imagerie d’assemblages de cellules potentiellement épaisses, ainsi qu’aux grands ensembles de données générés, doivent être surmontés.
Dans cet article, une méthode robuste basée sur un échafaudage pour la production à grande échelle de MCTS dans un format de 96 puits est présentée. La méthode facilite la production de plusieurs centaines d’assemblages de cellules 3D dans chaque puits. Des exemples sont présentés pour trois types de cellules différents, représentant des modèles de tumeurs solides du foie, du poumon et du côlon. Les sphéroïdes qui se forment peuvent être de différentes tailles, et donc HCA est utilisé pour sélectionner des structures d’une taille et / ou d’une morphologie particulière. Cette caractéristique offre l’avantage supplémentaire que tous les phénotypes observés peuvent être comparés entre des sphéroïdes de tailles différentes, mais tous traités de la même manière dans le même puits. Cette approche est compatible avec l’imagerie à haute résolution, fournissant de manière importante des données quantitatives au niveau cellulaire et subcellulaire provenant des mêmes assemblages cellulaires. Cette méthode de production de sphéroïdes présente l’avantage supplémentaire par rapport aux méthodes qui génèrent un seul sphéroïde par puits, que le grand nombre de sphéroïdes produits dans chaque puits fournit potentiellement suffisamment de biomasse pour d’autres analyses en aval, telles que le transcriptome et le profilage du protéome.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’approche décrite ici détaille une plate-forme permettant de générer plusieurs centaines de sphéroïdes par puits d’une manière adaptée aux HCS et HCA. Par rapport à d’autres méthodes populaires, telles que l’utilisation de plaques ULA à fond plat et à fond rond, qui permettent la formation d’un seul sphéroïde par puits18,19, cette méthode offre la possibilité d’extraire des informations à haute résolution d’un grand nombre de sph?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent le soutien d’une subvention de recherche sur les infrastructures de la Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) à JCS. Les travaux du laboratoire de dépistage cellulaire de l’UCD sont soutenus par le Collège des sciences de l’UCD. ASC est financé par une bourse d’études supérieures du gouvernement irlandais de la recherche (IRC) (GOIPG / 2019/68). Les auteurs remercient également tous les membres du laboratoire pour leur contribution et leurs discussions utiles. L’illustration de la figure 1 a été générée dans BioRender.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
Riferimenti
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784 (2020).
- Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
- Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods’ interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. Microscopy-based high-content screening. Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).
- Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
- Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
- Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033 (2019).
- Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
- Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).
- Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
- Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904 (2020).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
- Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).
