Eine robuste Methode für die großtechnische Produktion von Sphäroiden für High-Content-Screening- und Analyseanwendungen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von drei verschiedenen Arten von Sphäroiden in einer Weise, die sie für ein groß angelegtes High-Content-Screening und -Analyse geeignet macht. Darüber hinaus werden Beispiele vorgestellt, die zeigen, wie sie auf Sphäroid- und Einzelzellebene analysiert werden können.

Abstract

High-Content-Screening (HCS) und High-Content-Analyse (HCA) sind Technologien, die Forschern die Möglichkeit geben, groß angelegte quantitative phänotypische Messungen aus Zellen zu extrahieren. Dieser Ansatz hat sich als wirksam erwiesen, um unser Verständnis einer breiten Palette von grundlegenden und angewandten Ereignissen in der Zellbiologie zu vertiefen. Bis heute stützte sich die Mehrheit der Anwendungen für diese Technologie auf die Verwendung von Zellen, die in Monoschichten gezüchtet wurden, obwohl zunehmend erkannt wird, dass solche Modelle viele der Wechselwirkungen und Prozesse, die in Geweben auftreten, nicht rekapitulieren. Daher hat sich bei der Entwicklung und Verwendung von 3-dimensionalen (3D) Zellanordnungen wie Sphäroiden und Organoiden eine Entstehung herausgebildet. Obwohl diese 3D-Modelle im Kontext von Krebsbiologie- und Drug-Delivery-Studien besonders leistungsfähig sind, stellen ihre Herstellung und Analyse in einer reproduzierbaren Weise, die für HCS und HCA geeignet ist, eine Reihe von Herausforderungen dar. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von multizellulären Tumorsphäroiden (MCTS) und zeigt, dass es auf drei verschiedene Zelllinien in einer Weise angewendet werden kann, die mit HCS und HCA kompatibel ist. Das Verfahren erleichtert die Herstellung von mehreren hundert Sphäroiden pro Bohrloch und bietet den spezifischen Vorteil, dass bei Verwendung in einem Screening-Regime Daten aus mehreren hundert Strukturen pro Bohrloch gewonnen werden können, die alle auf identische Weise behandelt werden. Es werden auch Beispiele bereitgestellt, die detailliert beschreiben, wie die Sphäroide für die hochauflösende Fluoreszenzbildgebung verarbeitet werden und wie HCA quantitative Merkmale sowohl auf Sphäroidebene als auch aus einzelnen Zellen innerhalb jedes Sphäroides extrahieren kann. Dieses Protokoll könnte leicht angewendet werden, um eine Vielzahl wichtiger Fragen in der Zellbiologie zu beantworten.

Introduction

Traditionell wurden zellbasierte Assays in Monoschichten durchgeführt, die auf einem festen Substrat wachsen, das effektiv als zweidimensionale (2D) Umgebung betrachtet werden kann. Es wird jedoch zunehmend erkannt, dass 2D-Zellkulturmodelle in einigen Kontexten keine physiologische Relevanz haben und viele der komplexen Interaktionen, die zwischen Zellen auftreten, nicht replizieren ^können1. Dreidimensionale (3D) Zellkulturmethoden werden bei Forschern immer beliebter, und 3D-Zellmodelle zeigen ein hohes Potenzial, die physiologischen Bedingungen, mit denen Zellen in der Gewebeumgebung konfrontiert sind, besser nachzuahmen2^. Es gibt verschiedene Arten von 3D-Zellbaugruppen, die verwendet wurden, aber die beiden häufigsten Typen sind Sphäroide und Organoide. Sphäroide können aus vielen verschiedenen Zelllinien gezüchtet werden, und sie können je nach verwendetem Zelltyp und ihrer Montagemethode verschiedene Formen und Größen ^annehmen3. Darüber hinaus können Sphäroide auch als multizelluläre Tumorsphäroide (MCTS) bezeichnet werden, wenn sie aus Krebszelllinien gezüchtet werden, und diese Modelle haben besondere Verwendung für präklinische In-vitro-Arzneimittelverabreichungs– und Toxizitätsstudien ^gefunden4,5. Organoide hingegen zielen darauf ab, die Gewebe und Organe in unserem Körper besser nachzuahmen und können komplexere morphologische Anordnungen annehmen. Die Produktion von Organoiden beinhaltet die Verwendung von adulten Stammzellen oder pluripotenten Stammzellen, die in die entsprechenden Zellen umprogrammiert werden können, um dem interessierenden Gewebe oder Organ zu ähneln. Sie werden vor allem eingesetzt, um die Entwicklung von Organen zu untersuchen und Krankheiten und Wirt-Pathogen-Interaktionen zu ^{modellieren6.}

Es gibt eine Reihe von verschiedenen Methoden, um 3D-Zellbaugruppen zu erzeugen. Gerüstbasierte Methoden bieten ein Substrat oder eine Unterstützung, an die sich Zellen entweder anheften oder darin wachsen können. Diese Gerüste können verschiedene Formen haben und aus einer Vielzahl von verschiedenen Materialien hergestellt werden. Am häufigsten sind extrazelluläre Matrixkomponenten (ECM) und Hydrogele, die so konzipiert sind, dass sie der natürlichen extrazellulären Umgebung von Zellen ähneln und dadurch physiologische Interaktionen ^{erleichtern4,7}. ECM-Kellermaterial wurde aus dem Engelbreth-Holm-Swarm-Maussarkom-Tumor extrahiert und enthält nachweislich eine reichhaltige Mischung von ECM-Komponenten, einschließlich Laminin, Typ-IV-Kollagen und ^Perlecan8. Trotz seiner vorteilhaften Zusammensetzung gibt es jedoch zwei Hauptherausforderungen bei seiner Verwendung, nämlich seine Variabilität von Charge zu Charge und dass es zwei verschiedene Aggregatzustände unter und über 10 ° C ^8,9 aufweist. Im Gegensatz dazu haben Hydrogele den Vorteil, dass sie in Bezug auf ihre Komponenten und Steifigkeit flexibel sind und an die gewünschte 3D-Zellbaugruppe angepasst werden ^können7,10. Gerüstbasierte Methoden sind für das Organoidwachstum unerlässlich, werden aber auch häufig für Sphäroide verwendet. Gerüstfreie Methoden, die verhindern, dass sich Zellen an der Oberfläche festsetzen, auf der sie wachsen, sind in der Regel nur mit der Sphäroidmontage kompatibel. Beispiele hierfür sind Ultra-Low-Attachment-Platten (ULA) mit entweder flachem Boden oder U-Boden, die eine Aggregation der Zellen zu Sphäroiden ermöglichen, oder die Verwendung einer kontinuierlichen Bewegung der Zellen in Spinner-/^{Rotationskolben10.}

Die Verwendung von 3D-Zellanordnungen zur Untersuchung einer Vielzahl von biologischen Ereignissen gewinnt schnell an Popularität; Es ist jedoch von wesentlicher Bedeutung, dass die für ihre Kultur gewählte Methode angemessen und mit den Plänen für ihre nachgelagerte Analyse vereinbar ist. Zum Beispiel erzeugt die Verwendung von ULA-Platten Sphäroide von hoher Konsistenz; Diese Methode beschränkt sich jedoch auf die Herstellung eines einzelnen Sphäroids pro Well, wodurch der Durchsatz begrenzt wird. Besondere Beachtung ist geboten, wenn die Fluoreszenzbildgebung der 3D-Struktur geplant ist. Das Substrat oder die Platte, auf der die Baugruppe angebaut wird, muss optisch kompatibel sein, und es muss darauf geachtet werden, die Auswirkungen der Lichtstreuung, die durch möglicherweise verwendete Gerüste verursacht wird^{, zu minimieren11.} Dieses spezielle Problem wird akuter, wenn die numerische Blende der Objektivlinsen des Mikroskops zunimmt.

Einer der Hauptgründe für die Auswahl der Arbeit mit einem 3D-Zellmodell ist wohl die Extraktion volumetrischer Bilddaten nicht nur über die gesamte Baugruppe, sondern auch über die einzelnen Zellen darin. Insbesondere MCTS-Modelle beginnen sich als sehr leistungsfähig zu erweisen, um unser Verständnis dafür zu vertiefen, wie Therapeutika von außen zu zentralen Zellen gelangen (wie sie es in einem Tumor benötigen würden⁾¹², und daher ist es wichtig, Wissen von einzelnen Zellen auf verschiedenen Schichten zu gewinnen. Die bildgebende Technologie, die quantitative Informationen aus einzelnen Zellen extrahiert, wird als High-Content-Analyse (HCA) bezeichnet und ist ein leistungsfähiger Ansatz im Kontext des ^Screenings13. Bisher wurde HCA fast ausschließlich auf Monolayer-Kulturen angewendet, aber es gibt eine zunehmende Erkenntnis, dass dieser Ansatz die Kraft hat, auf 3D-Kulturen angewendet zu werden, so dass eine breite Palette von zellulären Funktionen und Prozessen untersucht werden ^kann14. Es hätte den klaren Vorteil, dass eine große Anzahl von 3D-Baugruppen analysiert werden könnte, die möglicherweise Daten auf Zellebene aus jeder Struktur liefern. Die Herausforderungen, die mit der Bildgebung von potenziell dickzelligen Baugruppen verbunden sind, sowie die großen Datensätze, die generiert werden, müssen jedoch überwunden werden.

In diesem Artikel wird ein robustes gerüstbasiertes Verfahren zur Großserienfertigung von MCTS im 96-Well-Format vorgestellt. Das Verfahren ermöglicht die Herstellung von mehreren hundert 3D-Zellbaugruppen in jedem Bohrloch. Es werden Beispiele für drei verschiedene Zelltypen gezeigt, die solide Tumormodelle von Leber, Lunge und Dickdarm darstellen. Die Sphäroide, die sich bilden, können von einer Vielzahl von Größen sein, und so wird HCA verwendet, um Strukturen einer bestimmten Größe und / oder Morphologie auszuwählen. Diese Eigenschaft bietet den zusätzlichen Vorteil, dass alle beobachteten Phänotypen über Sphäroide unterschiedlicher Größe hinweg verglichen werden können, aber alle auf die gleiche Weise im selben Brunnen behandelt werden. Dieser Ansatz ist mit hochauflösender Bildgebung kompatibel und liefert sowohl quantitative Daten auf Zellebene als auch auf subzellulärer Ebene von denselben zellulären Anordnungen. Diese Methode der Sphäroidproduktion hat gegenüber Methoden, die ein einzelnes Sphäroid pro Bohrloch erzeugen, den zusätzlichen Vorteil, dass die große Anzahl von Sphäroiden, die in jedem Bohrloch produziert werden, möglicherweise genügend Biomasse für andere nachgelagerte Analysen wie Transkriptom- und Proteomprofilierung liefert.

Protocol

1. Zellkultur Medien vorbereiten Bereiten Sie je nach Art der Zelllinie spezifische Zellkulturmedien vor. Stellen Sie sicher, dass alle Medien für die Zellerhaltung 10% fötales Rinderserum (FBS) enthalten.HINWEIS: Verschiedene Zelllinien verwenden unterschiedliche Medien. HT-29 Dickdarmkarzinomzellen (ATCC HTB-38) werden in McCoys 5A + 10% FBS gezüchtet. HepG2 hepatozelluläre Karzinomzellen (ATCC HB-8065) werden in Minimum Essential Medium + 1% L-Glutamin + 10% FBS gezüchtet. H…

Representative Results

In diesem Protokoll wird eine robuste Methode zur Herstellung von 3D-Zellkulturanordnungen in Form von Sphäroiden beschrieben, bei denen verschiedene Zelltypen verwendet werden, um verschiedene Tumorgewebe darzustellen. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung von Hunderten von Sphäroiden pro Well, wodurch zellbasierte Assays in einer High-Content-Weise durchgeführt werden können (Abbildung 1). Dieser Ansatz wurde zuvor verwendet, um die Aufnahme von Nanopartikeln …

Discussion

Der hier beschriebene Ansatz beschreibt eine Plattform zur Erzeugung von mehreren hundert Sphäroiden pro Bohrloch in einer Weise, die für HCS und HCA geeignet ist. Im Vergleich zu anderen populären Methoden, wie der Verwendung von ULA-Platten mit flachem und rundem Boden, die die Bildung von nur einem Sphäroid pro Bohrloch ^{ermöglichen18,19}, bietet diese Methode die Möglichkeit^, hochauflösende Informationen aus einer großen Anzahl von Sphäroiden in einem …

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red	Gibco	25300054
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A6003
Calcium chloride	Fisher Scientific	10050070
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid	Perkin Elmer	6055302	These plates have been renamed as Phenoplates
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated	Gibco	10500064
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11029
L-Glutamine solution, 200 mM	Gibco	25030024
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	14533
Magnesium chloride	Fisher Scientific	10647032
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL	Corning	356237	This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences
Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel	BD Biosciences	356231	This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning
McCoy's 5A medium	Gibco	26600023
McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red	Hyclone	10358633
Minimum Essential Medium (MEM)	Gibco	21090022
Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red	Gibco	51200046
Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate)	Developmental Studies Hybridoma Bank	H4A3-a
Neubauer counting chamber	Hirschmann	8100203
Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm	ThermoFisher Scientific	150350
Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software	Perkin Elmer	HCSHH14000000
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148
Phalloidin Alexa Fluor 568	Invitrogen	A12380
Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets	Sigma Aldrich	P4417
Polysorbate 20	Sigma Aldrich	P5927
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	61870010
RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red	Gibco	11835063
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
Stericup sterile vacuum filter units	Millipore	SCGVU05RE