Um método robusto para a produção em larga escala de spheroids para aplicativos de triagem e análise de alto conteúdo
Summary
Este protocolo detalha um método para a produção de três tipos diferentes de esferoides de uma maneira que os torna adequados para triagem e análise de alto conteúdo em larga escala. Além disso, são apresentados exemplos mostrando como eles podem ser analisados nos níveis esferoide e células individuais.
Abstract
A triagem de alto teor de conteúdo (HCS) e a análise de alto teor de conteúdo (HCA) são tecnologias que fornecem aos pesquisadores a capacidade de extrair medições fenotípicas quantitativas em larga escala das células. Essa abordagem tem se mostrado poderosa para aprofundar nossa compreensão de uma ampla gama de eventos fundamentais e aplicados na biologia celular. Até o momento, a maioria das aplicações para essa tecnologia tem se apoiado no uso de células cultivadas em monocamadas, embora se realize cada vez mais que tais modelos não recapitulem muitas das interações e processos que ocorrem nos tecidos. Como tal, houve um surgimento no desenvolvimento e uso de conjuntos celulares tridimensionais (3D), como esferoides e organoides. Embora esses modelos 3D sejam particularmente poderosos no contexto de estudos de biologia do câncer e entrega de medicamentos, sua produção e análise de forma reprodutível adequada para o HCS e hca apresentam uma série de desafios. O protocolo aqui detalhado descreve um método para a geração de esferoides tumorais multicelulares (MCTS), e demonstra que ele pode ser aplicado a três linhas celulares diferentes de forma compatível com HCS e HCA. O método facilita a produção de várias centenas de esferoides por poço, proporcionando a vantagem específica de que, quando utilizados em um regime de triagem, os dados podem ser obtidos a partir de várias centenas de estruturas por poço, todas tratadas de forma idêntica. Também são fornecidos exemplos, que detalham como processar os esferoides para imagens de fluorescência de alta resolução e como o HCA pode extrair características quantitativas tanto no nível esferoide quanto em células individuais dentro de cada esferoide. Este protocolo poderia ser facilmente aplicado para responder a uma ampla gama de questões importantes na biologia celular.
Introduction
Tradicionalmente, ensaios baseados em células têm sido realizados em monocamadas crescendo em um substrato sólido, que efetivamente pode ser considerado como um ambiente bidimensional (2D). No entanto, está se tornando cada vez mais reconhecido que os modelos de cultura celular 2D carecem de relevância fisiológica em alguns contextos e não conseguem replicar muitas das interações complexas que ocorrem entre as células1. Os métodos de cultura celular tridimensional (3D) estão rapidamente se tornando populares entre os pesquisadores, e modelos de células 3D mostram alto potencial para imitar melhor as condições fisiológicas encontradas pelas células no ambiente tecidual2. Existem vários tipos diferentes de conjuntos de células 3D que foram empregados, mas os dois tipos mais comuns são esferoides e organoides. Esferoides podem ser cultivados a partir de muitas linhas celulares diferentes, e eles podem adotar várias formas e tamanhos, dependendo do tipo de célula usada e seu método de montagem3. Além disso, os esferoides também podem ser chamados de esferoides de tumores multicelulares (MCTS) quando são cultivados a partir de linhas de células cancerosas, e esses modelos têm encontrado uso especial para estudos pré-clínicos de entrega de medicamentos in vitro e toxicidade4,5. Os organoides, por outro lado, visam imitar melhor os tecidos e órgãos do nosso corpo e podem adotar arranjos morfológicos mais complexos. A produção de organoides envolve o uso de células-tronco adultas ou células-tronco pluripotentes, que podem ser reprogramadas nas células apropriadas para se assemelhar ao tecido ou órgão de interesse. Eles são usados principalmente para investigar o desenvolvimento de órgãos e para modelar doenças e interações hospedeiro-patógeno6.
Há uma gama de diferentes métodos usados para gerar conjuntos de células 3D. Os métodos baseados em andaimes fornecem um substrato ou suporte ao qual as células podem se conectar ou crescer dentro. Estes andaimes podem ter várias formas e podem ser feitos a partir de uma variedade de materiais diferentes. Os mais comuns são componentes e hidrogéis de matriz extracelular (ECM), e são projetados para se assemelhar ao ambiente extracelular natural das células e, assim, facilitar interações fisiológicas4,7. O material do porão ECM foi extraído do tumor de sarcoma do rato Engelbreth-Holm-Swarm e mostrado conter uma rica mistura de componentes ECM, incluindo laminina, colágeno tipo IV e perlecan8. No entanto, apesar de sua composição vantajosa, há dois desafios principais com seu uso, ou seja, sua variabilidade lote-a-lote e que possui dois estados agregados diferentes abaixo e acima de 10 °C8,9. Em contraste, os hidrogéis têm a vantagem de serem flexíveis em relação aos seus componentes e rigidez, e podem ser personalizados para se adequarem ao conjunto específico de células 3D desejado7,10. Métodos à base de andaimes são essenciais para o crescimento organoide, mas também são amplamente utilizados para esferoides. Métodos livres de andaimes, que funcionam impedindo que as células se conectem à superfície em que estão crescendo, geralmente são compatíveis apenas com o conjunto esferoide. Exemplos incluem placas de fixação ultra-baixa (ULA), com fundo plano ou fundo U, que permitem a agregação das células em esferoides, ou o uso de agitação contínua das células em frascos rotadores/rotatório10.
O uso de conjuntos de células 3D para estudar uma grande variedade de eventos biológicos está rapidamente ganhando popularidade; no entanto, é essencial que o método escolhido para sua cultura seja apropriado e compatível com os planos para sua análise a jusante. Por exemplo, o uso de placas ULA gera esferoides de alta consistência; no entanto, este método está restrito à produção de um único esferoide por bem, limitando assim o rendimento. Consideração especial é necessária quando a imagem de fluorescência da estrutura 3D é planejada. O substrato ou placa em que o conjunto é cultivado precisa ser opticamente compatível, e deve-se tomar cuidado para minimizar os efeitos da dispersão de luz causada por quaisquer andaimes que possam ter sido usados11. Este problema em particular torna-se mais agudo à medida que a abertura numérica das lentes objetivas do microscópio aumenta.
Sem dúvida, uma das principais razões para selecionar para trabalhar com um modelo de célula 3D é extrair dados de imagem volumosa sobre não apenas todo o conjunto, mas também as células individuais dentro dele. Os modelos MCTS, em particular, estão começando a se mostrar muito poderosos para aprofundar nossa compreensão de como a terapêutica transita de fora para as células centrais (como precisariam em um tumor)12, e assim ganhar conhecimento de células individuais em diferentes camadas é essencial. A tecnologia de imagem que extrai informações quantitativas de células individuais é denominada análise de alto conteúdo (HCA) e é uma abordagem poderosa no contexto da triagem13. Até o momento, o HCA tem sido aplicado quase exclusivamente às culturas de monocamadas, mas há uma percepção crescente de que essa abordagem tem o poder de ser aplicada às culturas 3D, permitindo que uma ampla gama de funções e processos celulares sejam estudados14. Teria a clara vantagem de que um grande número de conjuntos 3D poderia ser analisado, potencialmente fornecendo dados de nível celular de cada estrutura. No entanto, os desafios associados à imagem de conjuntos celulares potencialmente espessos, bem como os grandes conjuntos de dados gerados, precisam ser superados.
Neste artigo, é apresentado um método robusto baseado em andaimes para a produção em larga escala de MCTS em formato de 96 poços. O método facilita a produção de várias centenas de conjuntos de células 3D em cada poço. Exemplos são mostrados para três tipos diferentes de células, representando modelos de tumor sólidos do fígado, pulmão e cólon. Os esferoides que formam podem ser de uma variedade de tamanhos, e por isso o HCA é usado para selecionar estruturas de um determinado tamanho e/ou morfologia. Este recurso fornece a vantagem adicional de que quaisquer fenótipos observados podem ser comparados entre esferoides de diferentes tamanhos, mas todos tratados da mesma forma no mesmo poço. Esta abordagem é compatível com imagens de alta resolução, fornecendo, importantemente, dados quantitativos de nível celular e subcelular dos mesmos conjuntos celulares. Este método de produção de esferoides tem a vantagem adicional sobre métodos que geram um único esferoide por permérito, que o grande número de esferoides produzidos em cada poço potencialmente fornecem biomassa suficiente para outras análises a jusante, como transcriptome e profilto de proteome.
Protocol
Representative Results
Discussion
A abordagem descrita aqui detalha uma plataforma para gerar várias centenas de esferoides por poço de uma maneira adequada para HCS e HCA. Em comparação com outros métodos populares, como o uso de placas ULA de fundo plano e de fundo redondo, que permitem a formação de apenas um poço esferoide por 18,19, este método oferece a oportunidade de informações de alta resolução serem extraídas de um grande número de esferoides em um formato de triagem. No…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o apoio de uma bolsa de pesquisa de infraestrutura da Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) à JCS. O trabalho no Laboratório de Triagem de Células da UCD é apoiado pela Faculdade de Ciências da UCD. A ASC é financiada por uma Bolsa de Pós-Graduação do Governo da Irlanda (GOIPG/2019/68) do Conselho de Pesquisa Irlandesa (IRC). Os autores também agradecem a todos os membros do laboratório por sua contribuição e discussões úteis. A obra de arte na Figura 1 foi gerada em BioRender.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
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