Isolamento e screening dalla biodiversità del suolo per i funghi coinvolti nella degradazione dei materiali recalcitranti

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per lo screening della biodiversità del suolo per cercare ceppi fungini coinvolti nella degradazione di materiali recalcitranti. In primo luogo, i ceppi fungini in grado di crescere su acidi umici o lignocellulosa sono isolati. La loro attività viene poi testata sia in saggi enzimatici che su inquinanti come idrocarburi e plastiche.

Abstract

L’inquinamento ambientale è un problema crescente e l’identificazione dei funghi coinvolti nel processo di biorisanamento è un compito essenziale. Il suolo ospita un’incredibile diversità di vita microbica e può essere una buona fonte di questi funghi biorisanativi. Questo lavoro mira a cercare funghi del suolo con potenziale di biorisanamento utilizzando diversi test di screening. I terreni di coltura minerale integrati con sostanze recalcitranti come unica fonte di carbonio sono stati utilizzati come test di crescita. In primo luogo, le diluizioni del suolo sono state placcate su piastre di Petri con mezzo minerale modificato con acidi umici o lignocellulosa. Le colonie fungine in crescita sono state isolate e testate su diversi substrati, come miscele complesse di idrocarburi (petrolato e olio motore usato) e polveri di diversi polimeri plastici (PET, PP, PS, PUR, PVC). Test enzimatici qualitativi sono stati associati ai test di crescita per studiare la produzione di esterasi, laccasi, perossidasi e proteasi. Questi enzimi sono coinvolti nei principali processi di degradazione del materiale recalcitrante e la loro secrezione costitutiva da parte dei ceppi fungini esaminati potrebbe avere il potenziale per essere sfruttata per il biorisanamento. Più di 100 ceppi sono stati isolati e testati e sono stati trovati diversi isolati con un buon potenziale di biorisanamento. In conclusione, i test di screening descritti sono un metodo semplice e a basso costo per identificare ceppi fungini con potenziale di biorisanamento dal suolo. Inoltre, è possibile personalizzare i test di screening per diversi inquinanti, in base alle esigenze, aggiungendo altre sostanze recalcitranti a terreni di coltura minimi.

Introduction

Il suolo è una componente fondamentale della vita sulla Terra ed è alla base di molti ecosistemi. I minerali, la materia organica e i microrganismi nel suolo possono essere considerati come un unico sistema, con strette associazioni e interazioni che si verificano tra di loro. Le interazioni di questi composti hanno un impatto importante sui processi terrestri, sulla qualità ambientale e sulla salute dell’ecosistema¹. L’inquinamento del suolo pone seri problemi ambientali in tutto il mondo. L’applicazione indiscriminata, a lungo termine ed eccessiva di sostanze recalcitranti e tossiche, come pesticidi, prodotti petroliferi, plastica e altre sostanze chimiche, ha gravi effetti sull’ecologia del suolo e, di conseguenza, può alterare il microbiota del suolo. Le comunità microbiche nei suoli sono composte da una vasta gamma di organismi in diversi stati fisiologici, la maggior parte dei quali sono batteri e funghi. Molti dei contaminanti nei suoli hanno stabilità a medio-lungo termine e la loro persistenza può portare allo sviluppo di meccanismi adattivi che consentono ai microrganismi di utilizzare sostanze recalcitranti come nutrienti ^2,3. Questi microrganismi possono, quindi, essere considerati per le tecniche di biorisanamento.

Il biorisanamento cerca di mitigare gli effetti dell’inquinamento utilizzando microrganismi e i loro enzimi per la degradazione o la trasformazione dei rifiuti in composti meno tossici o non tossici. Varie specie di archaea, batteri, alghe e funghi possiedono questa capacità di biorisanamento⁴. Come risultato delle loro particolari azioni biodegradative, i funghi sono organismi particolarmente promettenti per il biorisanamento. Possono attaccare diversi substrati usando la loro rete ifale, consentendo loro di penetrare nella matrice del suolo in modo più efficiente rispetto ad altri microrganismi. Inoltre, possono raggiungere interstizi inaccessibili in cui i contaminanti sono difficili da rimuovere⁵ e possono anche sopravvivere a bassi livelli di umidità⁶. Inoltre, i funghi sintetizzano diverse cassette di enzimi non specifici, di solito per degradare sostanze recalcitranti naturali come cellulosa, lignina e acidi umici. Quelli che mancano del substrato bersaglio possono essere coinvolti nella degradazione di una vasta gamma di inquinanti recalcitranti, come idrocarburi, plastica e pesticidi 7,8,9,10. Pertanto, sebbene molte specie fungine siano già state segnalate come agenti di biorisanamento, vi è un crescente interesse nell’esplorazione di specie che non sono ancora state studiate per selezionare candidati per il biorisanamento di sostanze contaminanti recalcitranti. Le specie già note per avere proprietà di biorisanamento appartengono ai phyla Ascomycota ^11,12,13, Basidiomycota^14,15 e Mucoromycota. Ad esempio, i generi Penicillium e Aspergillus sono ben noti per essere coinvolti nella degradazione degli idrocarburi alifatici¹³, diversi polimeri plastici 16,17,18, metalli pesanti ¹⁹ e coloranti²⁰. Allo stesso modo, studi condotti su funghi basidiomiceti, come Phanerochaete chrysosporium e Trametes versicolor, hanno rivelato il loro coinvolgimento nell’ossidazione di materiali recalcitranti come gli idrocarburi aromatici¹³ e le plastiche²¹. Un altro esempio di funghi coinvolti nei processi di biodegradazione sono gli zigomiceti Rhizopus spp., Mucor spp. e Cunninghamella ^spp.22,23. In particolare, Cunninghamella è in grado di ossidare idrocarburi aromatici ed è considerata un organismo modello per lo studio della disintossicazione di prodotti da una vasta gamma di xenobiotici¹³.

Ci sono diversi enzimi fungini coinvolti nei principali processi degradativi dei materiali recalcitranti ^24,25, come esterasi, laccasi, perossidasi e proteasi. Le laccasi sono ossidasi contenenti rame prodotte nella cellula e successivamente secrete, che permettono l’ossidazione di una varietà di composti fenolici e aromatici. Possono degradare orto e parafenoli, i fenoli contenenti gruppi amminici, la lignina e le diammine contenenti il gruppo arilico²⁶. Le perossidasi utilizzano il perossido di idrogeno come mediatore per degradare la lignina e altri composti aromatici. Ci sono molte perossidasi diverse, ma quelle con il maggior potenziale di degradare le sostanze tossiche sono la lignina perossidasi e la perossidasi di manganese²⁷.

Le esterasi e le proteasi appartengono al gruppo degli enzimi extra- o ecto-cellulari, che agiscono al di fuori delle loro cellule di origine ma sono ancora legati ad esse. Questi enzimi possono catalizzare l’idrolisi di grandi molecole recalcitranti in quelle più piccole. A causa della loro bassa specificità del substrato, questi enzimi possono svolgere un ruolo chiave nel biorisanamento di vari inquinanti, come coloranti tessili, effluenti rilasciati dalle industrie della cellulosa e della carta e concia della pelle, prodotti petroliferi, materie plastiche e pesticidi 28,29,30.

Sono già stati pubblicati numerosi metodi di screening per selezionare ceppi fungini biorisanativi. Ad esempio, il mezzo di agar a base di paglia è stato utilizzato per lo screening di funghi di marciume bianco ad alto potenziale nella degradazione degli idrocarburi policiclici aromatici (IPA)³¹; e piccoli pezzi di legno in decomposizione sono stati posti su agar estratto di malto (MEA) per isolare i funghi in decomposizione^{del legno 32}. Tuttavia, la maggior parte dei metodi che sono già stati proposti selezionano funghi molto specifici per la loro attività di interesse. Questa ricerca propone un approccio più ampio per la selezione dei funghi del suolo con un più ampio raggio d’azione. Il metodo si basa sulla placcatura iniziale di diluizioni seriali di campioni di terreno su un mezzo modificato con acidi umici o lignocellulosa mescolati con antibiotici per selezionare funghi con la capacità di degradare queste sostanze recalcitranti naturali. Gli acidi umici e la lignocellulosa, infatti, sono sostanze estremamente resistenti alla biodegradazione poiché hanno strutture molecolari molto complesse, e questo permette loro di essere ottimi indicatori della capacità degradativa dei funghi testati^33,34. Successivamente, i funghi selezionati nei primi test vengono sottoposti a screening per identificare quelli con il potenziale di degradare inquinanti specifici come petrolato, olio motore usato e plastica. Infine, vengono eseguiti test enzimatici qualitativi per rilevare ceppi fungini in grado di produrre enzimi coinvolti nei processi di biodegradazione di sostanze recalcitranti. A tale scopo vengono condotti test di proteasi e esterasi, mentre l’acido gallico e il guaiacolo sono utilizzati come indicatori della produzione di laccasi e di altri enzimi ligninolitici^35,36. Questi substrati sono utilizzati perché è stata trovata una forte correlazione tra la capacità dei funghi di ossidarli alla loro forma di colore marrone e il possesso di capacità ligninolitica 37,38,39.

Attraverso questi protocolli, è possibile isolare ceppi fungini ad alto potenziale degradativo e un ampio spettro di azione direttamente da campioni di suolo. L’isolamento di questi ceppi fungini potrebbe aiutare a trovare nuovi candidati per scopi di biorisanamento.

Protocol

1. Selezione di ceppi fungini in grado di degradare materiali recalcitranti dal suolo Preparazione della soluzione antibiotica. Mettere penicillina (50 mg / L), streptomicina (40 mg / L), clorttraciclina (40 mg / L), neomicina (100 mg / L) e cloramfenicolo (100 mg / L) in 250 ml di acqua sterile deionizzata. Prima di aggiungere cloramfenicolo alla soluzione antibiotica, scioglierlo in 3 ml di etanolo ≥99%. Posizionare la soluzione antibiotica su un agitatore magn…

Representative Results

I metodi di media selettivi (Sezione 1 del protocollo) hanno permesso di vagliare la ricca biodiversità del suolo e di selezionare i funghi con un elevato potenziale di biorisanamento. Con l’acido umico e la lignocellulosa, sono stati isolati più di 100 ceppi fungini. Questi funghi hanno prodotto enzimi coinvolti nella biodegradazione di materiali recalcitranti naturali, che hanno una struttura chimica simile a molti inquinanti. Tuttavia, i ceppi fungini isolati con i mezzi selettivi necessitavano di un ulteriore scree…

Discussion

La ricca biodiversità del suolo è una fonte abbondante di funghi che possiedono numerose capacità metaboliche, alcune delle quali potrebbero essere potenziali candidati per il biorisanamento. I test selettivi sui fluidi (Sezione 1 del protocollo) sono metodi facili da eseguire ed efficaci per isolare funghi in grado di crescere su polimeri complessi naturali come unica fonte di carbonio. I funghi possono produrre idrolasi extracellulari, non specifiche e ossidoreduttasi³⁰ come gli enzimi lignin…

Materials

96 microwell plate	Greiner bio-one	650185
Agar	VWR	84609.05
Bushnell-Haas Broth	Fluka	B5051
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
Chloroamphenicol	Eurobio	GABCRL006Z
Chlortetracycline	Sigma-Aldrich	Y0001451
CoCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	C8661
CuCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3279
Ethanol	VWR Chemicals	20821.296
FeCl3·6H2O	Sigma-Aldrich	236489
Filter 0.2 µm	Whatman	10462200
gallic acid	Sigma-Aldrich	G7384
Glass cover slips	Biosigma	VBS634
Glass vials 15 mL	SciLabware	P35467
guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502
High-density polyethylene (HDPE)	Sigma-Aldrich	434272
Humic acids	Aldrich Chemistry	53680
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P8281
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Lignocellulose	/	/	Sterilized bioethanol production waste
L-shaped cell spreader	Laboindustria S.p.a	21133
magnetic stirrer	A.C.E.F	8235
Malt Extract Broth	Sigma-Aldrich	70146
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M2643
Micropipette 1000 μL	Gilson	FA10006M
Micropipette 200  μL	Gilson	FA10005M
MnCl2·4H2O	Sigma-Aldrich	M5005
Na2MoO4·2H2O	Sigma-Aldrich	M1651
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
Neomycin	Sigma-Aldrich	N0401000
Penicillin	Sigma-Aldrich	1504489
peptone	Sigma-Aldrich	83059
Polyethylene terephthalate (PET)	Goodfellow	ES306031
Petri dishes	Laboindustria S.p.a	21050
Petrolatum (Paraffin liquid)	A.C.E.F	009661
Potato Dextrose Broth	Sigma-Aldrich	P6685
Polystyrene (PS)	Sigma-Aldrich	331651
Polyurethane (PUR)	Sigma-Aldrich	GF20677923
Polyvinyl chloride (PVC)	Sigma-Aldrich	81388
Sterile falcon tube	Greiner bio-one	227 261
Sterile glass vials 20 mL	Sigma-Aldrich	SU860051
Sterile point 1000  μL	Gilson	F172511
Sterile point 200  μL	Gilson	F172311
Sterile polyethylene bags	WHIRL-PAK	B01018
sterile syringe	Rays	5523CM25
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S-6501
Tween 80	Sigma-Aldrich	P1754
Used engine oil	/	/	complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company
Vials 50 mL	Sigma-Aldrich	33108-U
ZnCl2	Sigma-Aldrich	Z0152