सेंट्रल माइलिन में ट्यूबुलिन-निर्भर दोषों के अध्ययन के लिए लेबल-मुक्त गैर-रैखिक प्रकाशिकी
Summary
इस लेख में, हम एक सरल, अभिनव दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण के माध्यम से ट्यूबुलिनोपैथी के एक मॉडल में सूक्ष्मनलिका-लोडेड ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
मस्तिष्क में साइटोस्केलेटल घटकों का संतोषजनक विज़ुअलाइज़ेशन चुनौतीपूर्ण है। सभी तंत्रिका ऊतकों में सूक्ष्मनलिकाएं, माइक्रोफिलामेंट्स और मध्यवर्ती फिलामेंट्स के नेटवर्क का सर्वव्यापी वितरण, फ्लोरोसेंट प्रोटीन संलयन रणनीतियों के परिणामों में परिवर्तनशीलता और क्रोमोफोर वाहनों के रूप में एंटीबॉडी और दवाओं के गतिशील अध्ययन के लिए उनकी सीमित प्रयोज्यता, शास्त्रीय ऑप्टिकल दृष्टिकोण को अन्य प्रोटीनों के रूप में प्रभावी नहीं बनाता है। जब ट्यूबुलिन का अध्ययन करने की आवश्यकता होती है, तो अणु के गैर-सेंट्रोसिमेट्रिक संगठन के कारण दूसरे हार्मोनिक्स की लेबल-मुक्त पीढ़ी एक बहुत ही उपयुक्त विकल्प है। यह तकनीक, जब माइक्रोस्कोपी से संयुग्मित होती है, तो जैविक नमूनों में सूक्ष्मनलिकाएं के समानांतर बंडलों के वॉल्यूमेट्रिक वितरण का गुणात्मक रूप से वर्णन कर सकती है, ताजा ऊतकों के साथ काम करने के अतिरिक्त लाभ के साथ जो अनिर्धारित और अप्रतिबंधित हैं। यह काम बताता है कि ओलिगोडेंड्रोसाइट्स की ट्यूबुलिन-समृद्ध संरचनाओं में सूक्ष्मनलिकाएं उजागर करने के लिए एक वाणिज्यिक दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी माइक्रोस्कोपी सेटअप के साथ ट्यूबुलिन की छवि कैसे बनाई जाए, जैसा कि बेसल गैन्ग्लिया और सेरिबैलम (एच-एबीसी) ट्यूबुलिनोपैथी के शोष के साथ हाइपोमाइलिनेशन में है, जो हाल ही में वर्णित माइलिन विकार है।
Introduction
ऊतकों और अंग तैयारी में साइटोस्केलेटल संरचनाओं की ऑप्टिकल इमेजिंग एक आसान काम नहीं है। साइटोस्केलेटल फिलामेंट्स सर्वव्यापी हैं, इसलिए यदि जेनेरिक धुंधलापन किया जाता है, उदाहरण के लिए, उपकला नमूने में अल्फा-ट्यूबुलिन या बीटा-एक्टिन या संभावित रूप से केराटिन के खिलाफ, संकेत संभवतः पूरे नमूने में सजातीय रूप से वितरित किया जाएगा। सेलुलर घटकों के अधिक सार्थक उप-समूह तक धुंधलापन को प्रतिबंधित करने के लिए, कोई या तो लक्षित अभिव्यक्ति1 के साथ ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग कर सकता है या आइसोफॉर्म-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करने की योजना बना सकता है। जबकि उत्तरार्द्ध में से बहुत कम बाजार पर हैं (और बहुत कम 2,3,4 पर मौजूद हैं), एक ट्रांसजेनिक पशु मॉडल उपलब्ध हो सकता है। हालांकि, इसे प्रयोगशाला द्वारा अधिग्रहित करने और प्रक्रिया में शामिल सभी खर्चों के साथ ठीक से रखा जाना चाहिए। कुछ एंटीबॉडी या रसायन, उदाहरण के लिए, फ्लोरोफोरे-संयुग्मित दवाएं जैसे फैलोइडिन या पैक्लिटैक्सेल, जीवित कोशिकाओं या ऊतकों में उपयोग के साथ आंशिक रूप से या पूरी तरह से असंगत हो सकती हैं, इस प्रकार उनकी प्रयोज्यता को केवल निश्चित नमूनों के अध्ययन तक सीमित कर सकती हैं।
ट्यूबुलिन के मामले में, एक अतिरिक्त पहलू को ध्यान में रखा जाना चाहिए, जो निर्धारण के लिए बहुलक की संवेदनशीलता है। फॉर्मलाडेहाइड के साथ पारंपरिक रासायनिक निर्धारण सूक्ष्मनलिकाएं5 की अखंडता को बेहतर ढंग से संरक्षित करने के लिए पर्याप्त नहीं होने के लिए जाना जाता है। इसके अतिरिक्त, एक हालिया रिपोर्ट पुष्टि करती है कि फॉर्मलाडेहाइड क्रॉसलिंकिंग सूक्ष्मनलिका के अल्ट्रास्ट्रक्चर में सूक्ष्म परिवर्तन को प्रेरित करता है, जैसा कि जीटीपी6 जैसे कुछ दवाओं या शारीरिक अणुओं के बंधन के साथ होता है।
इसलिए, बिना दाग वाले, अनिर्धारित नमूनों में सूक्ष्मनलिकाएं का प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन अक्सर वांछनीय होता है। इसे प्राप्त करने के लिए, एक तकनीकी समाधान दूसरा हार्मोनिक जनरेशन (एसएचजी) माइक्रोस्कोपी7 है, जो समानांतर सूक्ष्मनलिकाएं के बंडलों की हार्मोनोफोर के रूप में कार्य करने और तीव्र, स्पंदित अवरक्त लेजर के साथ ठीक से रोशन होने पर आवृत्ति-दोगुना प्रकाश उत्सर्जित करने की क्षमता पर आधारित है। यद्यपि कोलेजन और मायोसिन से एक मजबूत और अधिक स्थिर दूसरा हार्मोनिक संकेत उत्पन्न किया जा सकता है, जो केवल दो अन्य जैविक सामग्री हैं जो आवृत्ति-दोहरीकरण में सक्षम होने के लिए जाने जाते हैं, ट्यूबुलिन से संकेत का उपयोग अब तक ज्यादातर माइटोटिक स्पिंडल पुनर्व्यवस्था 8,9,10 और अक्षीय सूक्ष्मनलिका आकृति विज्ञान 11,12,13 का अध्ययन करने के लिए किया गया है।
इस काम में, हम ट्यूबुलिन बीटा 4 ए (टीयूबी 4 ए) ट्यूबुलिनोपैथी से प्रभावित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस)ऊतकों को उनके स्वस्थ समकक्षों से अलग करने के लिए एक नैदानिक उपकरण के रूप में एसएचजी माइक्रोस्कोपी का एक नया उपयोग पेश करते हैं। ट्यूबुलिन के इस मुख्य रूप से तंत्रिका आइसोफॉर्म में होने वाले कुछ उत्परिवर्तन, जैसे बेसल गैन्ग्लिया और सेरिबैलम (एच-एबीसी) के हाइपोमाइलिनेशन और शोष का कारण बनते हैं, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स15,16 में सूक्ष्मनलिका ओवरफिलिंग को प्रेरित करते हैं; साइटोस्केलेटल परिवर्तन, बदले में, डिस्माइलिनेशन जैसे डाउनस्ट्रीम प्रभावों से जुड़े होते हैं, जिसमें मोटर और संवेदी मार्गों की गहरी हानि होती है 16,17,18,19. इस काम में उपयोग किया जाने वाला टाइप मुराइन मॉडल ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स में असामान्य सूक्ष्मनलिका सामग्री प्रदर्शित करता है और एच-एबीसी रोगियों के अधिकांश संवेदी-मोटर लक्षणों को पुन: उत्पन्न करताहै। प्रोटोकॉल बताता है कि कॉर्पस कॉलोसम और सेरिबैलम के रूप में संरचनाओं को कैसे चित्रित किया जाए, जो आमतौर पर अत्यधिक माइलिनेटेड होते हैं और जो मानव रोगियों के साथ-साथ ताइप चूहे19 में गंभीर रूप से प्रभावित होते हैं, स्वस्थ और उत्परिवर्ती ऊतकों के बीच एसएच संकेतों में अंतर को उजागर करने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
एसएचजी माइक्रोस्कोपी गैर-रैखिक प्रकाशिकी तकनीकों के एक समूह का हिस्सा है, जिसमें दो-फोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी, तीसरी हार्मोनिक पीढ़ी माइक्रोस्कोपी और सुसंगत एंटी-स्टोक्स रमन स्कैटरिंग माइक्रो?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को निम्नलिखित अनुदानों के माध्यम से कॉन्सेजो नेशनल डी सिएनसिया वाई टेक्नोलोजिया (CONACYT) द्वारा समर्थित किया गया था: वीपी-सीआईओ को अवसंरचनात्मक 226450, वीपी को 255277, और FORDECYT-PRONACES / 194171 / 2020 से V.H. हम वीडियो बनाने में सीआईओ में जुवेनल हर्नांडेज़ ग्वेरा के समर्थन को स्वीकार करते हैं।
Materials
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
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