Etikettfri ikke-lineær optikk for studier av tubulinavhengige defekter i sentral myelin

Summary

I denne artikkelen presenterer vi en protokoll for å oppdage mikrotubulibelastede oligodendrocytter i en modell av tubulinopati gjennom en enkel, innovativ andre harmonisk generasjons mikroskopi tilnærming.

Abstract

Tilfredsstillende visualisering av cytoskjelettkomponenter i hjernen er utfordrende. Den allestedsnærværende fordelingen av nettverkene av mikrotubuli, mikrofilamenter og mellomliggende filamenter i alle nevrale vev, sammen med variasjonen i resultatene av fluorescerende proteinfusjonsstrategier og deres begrensede anvendelighet til dynamiske studier av antistoffer og legemidler som kromoforbiler, gjør klassiske optiske tilnærminger ikke like effektive som for andre proteiner. Når tubulin må studeres, er den etikettfrie generasjonen av andre harmoniske en meget egnet alternativ på grunn av den ikke-sentrosymmetriske organisasjonen av molekylet. Denne teknikken, når den konjugeres til mikroskopi, kan kvalitativt beskrive den volumetriske fordelingen av parallelle bunter av mikrotubuli i biologiske prøver, med den ekstra fordelen av å arbeide med friske vev som er ufikserte og ugjennomtrengelige. Dette arbeidet beskriver hvordan man avbilder tubulin med et kommersielt andre harmonisk generasjonsmikroskopioppsett for å markere mikrotubuli i de tubulinberikede strukturer av oligodendrocytter, som i hypomyelinisering med atrofi av basalganglia og cerebellum (H-ABC) tubulinopati, en nylig beskrevet myelinforstyrrelse.

Introduction

Den optiske avbildningen av cytoskeletale strukturer i vev og organpreparater er ikke en lett oppgave. Cytoskeletale filamenter er allestedsnærværende, så hvis generisk farging utføres, for eksempel mot alfa-tubulin eller beta-aktin eller potensielt keratin i en epitelprøve, vil signalet sannsynligvis bli fordelt ganske homogent over hele prøven. For å begrense fargingen til en mer meningsfull delmengde av cellulære komponenter, kan man enten bruke transgene mus med målrettet uttrykk¹ eller planlegge å bruke isoformspesifikke antistoffer. Mens svært få av de sistnevnte er på markedet (og svært få eksisterer i det hele tatt ^2,3,4), kan en transgen dyremodell være tilgjengelig. Det må imidlertid anskaffes av laboratoriet og plasseres riktig, med alle utgifter involvert i prosessen. Visse antistoffer eller kjemikalier, for eksempel fluoroforkonjugerte legemidler som phalloidin eller paklitaksel, kan være delvis eller helt uforenlige med bruk i levende celler eller vev, og dermed begrense deres anvendelighet til bare studier av faste prøver.

Når det gjelder tubulin, må det tas hensyn til et ekstra aspekt, som er polymerens følsomhet for fiksering. Konvensjonell kjemisk fiksering med formaldehyd er kjent for ikke å være tilstrekkelig for optimal bevaring av integriteten til mikrotubuli⁵. I tillegg bekrefter en nylig rapport at formaldehyd tverrbinding induserer subtile endringer i mikrotubuliens ultrastruktur, som ligner på hva som skjer med bindingen av noen stoffer eller fysiologiske molekyler som GTP⁶.

Den direkte visualiseringen av mikrotubuli i ufargede, ufikserte prøver er derfor ofte ønskelig. For å oppnå dette er en teknisk løsning andre harmoniske generasjons (SHG) mikroskopi⁷, som er basert på evnen til bunter av parallelle mikrotubuli til å fungere som harmonoforer og å avgi frekvensdoblet lys når det er riktig opplyst med en intens, pulserende infrarød laser. Selv om et sterkere og mer stabilt andre harmonisk signal kan genereres fra kollagen og myosin, som er de eneste to andre biologiske materialene som er kjent for å være i stand til frekvensdobling, har signalet fra tubulin hittil blitt brukt mest til å studere mitotiske spindelomorganiseringer ^8,9,10 og aksonal mikrotubulimorfologi^11,12,13.

I dette arbeidet introduserer vi en ny bruk av SHG-mikroskopi som et diagnostisk verktøy for å skille sentralnervesystemet (CNS) vev påvirket av tubulin beta 4 A (TUBB4A) tubulinopati fra deres friske kolleger¹⁴. Noen av mutasjonene som forekommer i denne overveiende nevrale isoformen av tubulin, som de som forårsaker hypomyelinisering og atrofi av basalganglia og cerebellum (H-ABC), induserer overfylling av mikrotubuli i oligodendrocytter^15,16; De cytoskeletale endringene er i sin tur forbundet med nedstrøms effekter som dysmyelinisering, med dyp svekkelse av motoriske og sensoriske veier^16,17,18,19. Taiep-murinmodellen som brukes i dette arbeidet, viser unormalt mikrotubuliinnhold i oligodendrocytter og rekapitulerer de fleste sensorisk-motoriske symptomene hos H-ABC-pasienter¹⁷. Protokollen forklarer hvordan man avbilder strukturer som corpus callosum og cerebellum, som vanligvis er svært myeliniserte og som er sterkt påvirket hos menneskelige pasienter, så vel som i taiep-rotte ¹⁹, for å markere forskjellene i SH-signaler mellom sunt og mutant vev.

Protocol

Alle prosedyrer som er beskrevet ble gjort i samsvar med lovene og kodene som er godkjent i den syvende tittelen i forskriften om generell helselov om helseforskning av den meksikanske regjeringen (NOM-062-ZOO-1999) og i samsvar med anbefalingene fra National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av eksperimentelle dyr og ble godkjent av den institusjonelle komiteen for bioetikk i forskning fra Universidad de Guanajuato og Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. 1. Innstill…

Representative Results

Bildene oppnådd med denne metoden har et iboende lavt bakgrunnsnivå på grunn av det svært begrensede antallet harmoniforer som er tilstede i biologiske vev, noe som er en av de betydelige fordelene ved metoden. Når fibrene i corpus callosum er avbildet, kan fiberlignende korte strukturer og avrundede elementer konsekvent finnes i taiep-hjernen (figur 3B), mens corpus callosum i kontrollhjernen viser et mye mer heterogent og isotropisk signal i hele hjerneområdet (<strong class="…

Discussion

SHG-mikroskopi er en del av en gruppe ikke-lineære optikkteknikker, som inkluderer to-foton eksitasjonsmikroskopi, tredje harmoniske generasjonsmikroskopi og sammenhengende anti-Stokes Raman spredningsmikroskopi, som har bidratt til å utvide anvendelsesområdet for konvensjonell optisk mikroskopi til biovitenskap²⁰.

Spesielt er den største styrken og svakheten ved SHG-mikroskopi knyttet til samme tilstand: signalgeneratoren er ikke-sentrosymmetrisk^2…

Materials

405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter	Semrock	FF01-405/10-25	32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric	Thorlabs	BK5	5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick
Blades for vibratome	any commercial; e.g. Wilkinson Sword		Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm	any commercial; e.g. Falcon	351008
Confocal microscope	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Cooler	any commercial		Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach	e.g. Maizena		From the supermarket
Coverslips #1.5	any commercial		Rectangular
Cyanoacrylate glue	e.g. Loctite		To glue the brain to the masking tape
Fine forceps	fine science tools	11412-11	To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors	fine science tools	14370-22	To cut the skin
Fine scissors curved tip	fine science tools	14061-09	To cut along the midline
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	252549	To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur	fine science tools	16000-14	To cut the bone
Gel packs	any commercial		Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified	any commercial		To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS)	Gibco	14025-076	Could be prepared from powders
Kelly hemostats	fine science tools	13018-14	To separate the bone
Masking tape	any commercial		To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C	Zeiss	000000-1410-101	To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers	fine science tools	16101-10	To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-031	Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser	Coherent	Chameleon Vision II	680–1080 nm tunable laser
Scalpel	any commercial		Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps	fine science tools	11000-18
Vannas spring scissors	fine science tools	15018-10	To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome	any commercial; e.g. Leica	VT1200