Etikettfri icke-linjär optik för studier av tubulinberoende defekter i centrala Myelin

Summary

I den här artikeln presenterar vi ett protokoll för att detektera mikrotubulibelastade oligodendrocyter i en modell av tubulinopati genom en enkel, innovativ andra harmonisk generationens mikroskopimetod.

Abstract

Den tillfredsställande visualiseringen av cytoskelettkomponenter i hjärnan är utmanande. Den allestädes närvarande fördelningen av nätverken av mikrotubuli, mikrofilament och mellanliggande filament i alla neurala vävnader, tillsammans med variationen i resultaten av fluorescerande proteinfusionsstrategier och deras begränsade tillämplighet på dynamiska studier av antikroppar och läkemedel som kromoforfordon, gör klassiska optiska tillvägagångssätt inte lika effektiva som för andra proteiner. När tubulin behöver studeras är den etikettfria genereringen av andra övertoner ett mycket lämpligt alternativ på grund av molekylens icke-centrosymmetriska organisation. Denna teknik, när den konjugeras till mikroskopi, kan kvalitativt beskriva den volymetriska fördelningen av parallella buntar av mikrotubuli i biologiska prover, med den ytterligare fördelen att arbeta med färska vävnader som är ofixerade och oparfymerade. Detta arbete beskriver hur man avbildar tubulin med en kommersiell andra harmonisk generationens mikroskopiinställning för att markera mikrotubuli i oligodendrocyternas tubulinberikade strukturer, som vid hypomyelinering med atrofi av de basala ganglierna och cerebellum (H-ABC) tubulinopati, en nyligen beskriven myelinstörning.

Introduction

Den optiska avbildningen av cytoskelettstrukturer i vävnader och organpreparat är inte en lätt uppgift. Cytoskeletala filament är allestädes närvarande, så om generisk färgning utförs, till exempel mot alfa-tubulin eller beta-aktin eller potentiellt keratin i ett epitelprov, kommer signalen sannolikt att fördelas ganska homogent över hela provet. För att begränsa färgningen till en mer meningsfull delmängd av cellulära komponenter kan man antingen använda transgena möss med riktat uttryck¹ eller planera att använda isoformspecifika antikroppar. Även om väldigt få av de senare finns på marknaden (och väldigt få finns alls ^2,3,4), kan en transgen djurmodell finnas tillgänglig. Det måste dock förvärvas av labbet och ordentligt inrymmas, med alla kostnader som är involverade i processen. Vissa antikroppar eller kemikalier, till exempel fluoroforkonjugerade läkemedel som falloidin eller paklitaxel, kan vara delvis eller helt oförenliga med användning i levande celler eller vävnader, vilket begränsar deras tillämplighet till endast studier av fasta prover.

När det gäller tubulin måste en ytterligare aspekt beaktas, vilket är polymerens känslighet för fixering. Konventionell kemisk fixering med formaldehyd är känd för att inte vara tillräcklig för att optimalt bevara mikrotubuliens integritet⁵. Dessutom bekräftar en ny rapport att formaldehydkorsbindning inducerar subtila förändringar i mikrotubuliens ultrastruktur, liknande vad som händer med bindningen av vissa läkemedel eller fysiologiska molekyler som GTP⁶.

Den direkta visualiseringen av mikrotubuli i ostoppade, ofixerade prover är därför ofta önskvärt. För att uppnå detta är en teknisk lösning andra harmoniska generationens (SHG) mikroskopi⁷, som bygger på förmågan hos buntar av parallella mikrotubuli att fungera som harmonoforer och att avge frekvensfördubblat ljus när de är ordentligt upplysta med en intensiv, pulserad infraröd laser. Även om en starkare och stabilare andra harmonisk signal kan genereras från kollagen och myosin, som är de enda andra två biologiska materialen som är kända för att kunna frekvensfördubblas, har signalen från tubulin hittills använts mest för att studera mitotiska spindelomläggningar ^8,9,10 och axonal mikrotubulimorfologi^11,12,13.

I detta arbete introducerar vi en ny användning av SHG-mikroskopi som ett diagnostiskt verktyg för att skilja vävnader i centrala nervsystemet (CNS) som påverkas av tubulin beta 4 A (TUBB4A) tubulinopati från deras friska motsvarigheter¹⁴. Några av de mutationer som förekommer i denna övervägande neurala isoform av tubulin, som de som orsakar hypomyelinisering och atrofi av de basala ganglierna och cerebellum (H-ABC), inducerar mikrotubuliöverfyllning i oligodendrocyterna^15,16; Cytoskelettförändringarna är i sin tur förknippade med nedströms effekter som dysmyelinisering, med djup försämring av motoriska och sensoriska vägar^16,17,18,19. Taiep-murinmodellen som används i detta arbete visar onormalt mikrotubuliinnehåll i oligodendrocyterna och rekapitulerar de flesta sensoriska motoriska symtomen hos H-ABC-patienter¹⁷. Protokollet förklarar hur man avbildar strukturer som corpus callosum och lillhjärnan, som vanligtvis är mycket myeliniserade och som påverkas allvarligt hos mänskliga patienter såväl som i taiepråttan ¹⁹, för att belysa skillnaderna i SH-signaler mellan friska och mutanta vävnader.

Protocol

Alla beskrivna förfaranden gjordes i enlighet med de lagar och koder som godkänts i den sjunde titeln i förordningen om den allmänna hälsolagen om hälsoforskning från den mexikanska regeringen (NOM-062-ZOO-1999) och i enlighet med rekommendationerna från National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Experimental Animals och godkändes av den institutionella kommittén för bioetik i forskning vid Universidad de Guanajuato och Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. <s…

Representative Results

Bilderna som erhållits med denna metod har en inneboende låg bakgrundsnivå på grund av det mycket begränsade antalet harmonoforer som finns i biologiska vävnader, vilket är en av de betydande fördelarna med metoden. När fibrerna i corpus callosum avbildas kan fiberliknande korta strukturer och rundade element konsekvent hittas i taiep-hjärnan (figur 3B), medan corpus callosum i kontrollhjärnan visar en mycket mer heterogen och isotrop signal i …

Discussion

SHG-mikroskopi är en del av en grupp icke-linjära optiktekniker, som inkluderar tvåfotonexcitationsmikroskopi, tredje harmonisk generationsmikroskopi och koherent anti-Stokes Raman-spridningsmikroskopi, som har bidragit till att utöka utbudet av tillämpningar av konventionell optisk mikroskopi till livsvetenskaperna²⁰.

Specifikt relaterar SHG-mikroskopins huvudsakliga styrka och svaghet till samma tillstånd: signalgeneratorn är icke-centrosymmetrisk<sup class="xr…

Materials

405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter	Semrock	FF01-405/10-25	32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric	Thorlabs	BK5	5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick
Blades for vibratome	any commercial; e.g. Wilkinson Sword		Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm	any commercial; e.g. Falcon	351008
Confocal microscope	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Cooler	any commercial		Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach	e.g. Maizena		From the supermarket
Coverslips #1.5	any commercial		Rectangular
Cyanoacrylate glue	e.g. Loctite		To glue the brain to the masking tape
Fine forceps	fine science tools	11412-11	To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors	fine science tools	14370-22	To cut the skin
Fine scissors curved tip	fine science tools	14061-09	To cut along the midline
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	252549	To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur	fine science tools	16000-14	To cut the bone
Gel packs	any commercial		Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified	any commercial		To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS)	Gibco	14025-076	Could be prepared from powders
Kelly hemostats	fine science tools	13018-14	To separate the bone
Masking tape	any commercial		To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C	Zeiss	000000-1410-101	To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers	fine science tools	16101-10	To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-031	Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser	Coherent	Chameleon Vision II	680–1080 nm tunable laser
Scalpel	any commercial		Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps	fine science tools	11000-18
Vannas spring scissors	fine science tools	15018-10	To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome	any commercial; e.g. Leica	VT1200