I cibridi transmitocondriali sono cellule ibride ottenute fondendo cellule impoverite di DNA mitocondriale (mtDNA) (cellule rho0 ) con citoplasti (cellule enucleate) derivati da pazienti affetti da disturbi mitocondriali. Consentono la determinazione dell'origine nucleare o mitocondriale della malattia, la valutazione dell'attività biochimica e la conferma del ruolo patogenetico delle varianti correlate al mtDNA.
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Articolo metodologico
Un approccio in vitro per studiare la disfunzione mitocondriale: un modello di cibridi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La carenza dei complessi della catena respiratoria mitocondriale che effettuano la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) è il marcatore biochimico dei disturbi mitocondriali umani. Da un punto di vista genetico, l'OXPHOS rappresenta un esempio unico perché deriva dalla complementazione di due sistemi genetici distinti: il DNA nucleare (nDNA) e il DNA mitocondriale (mtDNA). Pertanto, i difetti di OXPHOS possono essere dovuti a mutazioni che colpiscono i geni codificati nucleari e mitocondriali.
Il lavoro pionieristico di King e Attardi, pubblicato nel 1989, ha dimostrato che le linee cellulari umane impoverite di mtDNA (chiamato rho0) potrebbero essere ripopolate dai mitocondri esogeni per ottenere i cosiddetti "cibridi transmitocondriali". Grazie a questi cibridi contenenti mitocondri derivati da pazienti con disturbi mitocondriali (MD) e nuclei da cellule rho0 , è possibile verificare se un difetto è correlato al mtDNA o all'nDNA. Questi cibridi sono anche un potente strumento per convalidare la patogenicità di una mutazione e studiarne l'impatto a livello biochimico. Questo documento presenta un protocollo dettagliato che descrive la generazione, la selezione e la caratterizzazione dei cibridi.
Introduzione
I disturbi mitocondriali (MD) sono un gruppo di sindromi multisistemiche causate da una compromissione delle funzioni mitocondriali a causa di mutazioni nel DNA1 nucleare (nDNA) o mitocondriale (mtDNA). Sono tra le malattie metaboliche ereditarie più comuni, con una prevalenza di 1:5.000. Le malattie associate al mtDNA seguono le regole della genetica mitocondriale: ereditarietà materna, eteroplasmia ed effetto soglia e segregazione mitotica2. Il mtDNA umano è un cerchio di DNA a doppio filamento di 16,6 kb, che contiene una breve regione di controllo con sequenze necessarie per la replicazione e la trascrizione, 13 geni....
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Protocollo
NOTA: L'uso di fibroblasti umani può richiedere l'approvazione etica. I fibroblasti utilizzati in questo studio sono stati derivati da pazienti con MD e conservati nella biobanca istituzionale in conformità con i requisiti etici. È stato fornito il consenso informato per l'uso delle cellule. Eseguire tutte le procedure di coltura cellulare in un armadio a flusso laminare sterile a temperatura ambiente (RT, 22-25 °C). Utilizzare soluzioni filtrate sterili adatte per colture cellulari e apparecchiature sterili. Far crescere tutte le linee cellulari in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2. I test del micoplasma dovrebbero essere condotti settiman....
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Risultati
La generazione di cybrid richiede 3 giorni di lavoro di laboratorio più un periodo di selezione (~ 2 settimane) e ulteriori 1-2 settimane per la crescita dei cloni. I passaggi critici sono la qualità dei citoplasti e il periodo di selezione. La morfologia dei cibridi assomiglia a quella delle cellule donatrici rho0. L'assegnazione del mtDNA e dell'nDNA corretti nei cibridi è obbligatoria per confermare l'identità delle cellule. Un esempio è riportato nella Figura 2. In questo caso.......
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Discussione
Il mtDNA ha un tasso di mutazione molto elevato rispetto all'nDNA a causa della mancanza di istoni protettivi e della sua posizione vicino alla catena respiratoria, che espone la molecola a dannosi effetti ossidativi non efficacemente contrastati dai sistemi di riparazione16. Le prime mutazioni patogenetiche del mtDNA sono state identificate nel 198817,18 e da allora è stato descritto un gran numero di mutazioni. La tecnologia NGS è un app.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato condotto nel Centro per lo Studio delle Malattie Mitocondriali Pediatriche (http://www.mitopedia.org), finanziato dalla Fondazione Mariani. VT è membro dell'European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5-Bromo-2'-Deossiuridina | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| Piastre a 6 pozzetti | Corning | 3516 | |
| Piastre a 96 pozzetti | Corning | 3596 | |
| Kit di estrazione del DNA per colture di sangue e cellule | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuga | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7.200 rcf, 37 gradi C |
| Flaconi da centrifuga, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Citocalasina B da Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| FBS dializzato | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM Alto glucosio (senza L-glutammina con piruvato di sodio) | EuroClone | ECB7501L | |
| soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco - PBS (con o Calcio senza Magnesio) | EuroClone | ECB4004L | |
| Etanolo Anidro Assoluto | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Prodotto a base di siero bovino) | Cytiva - HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Pipette in vetro pasteur | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Microscopio da ricerca invertito per microscopia su cellule vive | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Rotore in alluminio ad angolo fisso | Beckman Coltro | 339247 | |
| Autoclave da laboratorio Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutammina 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimo Essenziale Medio MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Kit di rilevamento del micoplasma | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (soluzione di polietilene glicole) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillina-streptomicina (soluzione 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Piastre 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Piastre 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Piruvato di sodio 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscopio | Nikon | SMZ1000 | |
| tripsina 2,5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridina | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
Riferimenti
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).
- DiMauro, S., Davidzon, G. Mitochondrial DNA and disease. Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).
- El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F.
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Ristampe e permessi
