Måling av vev ikke-heme jerninnhold ved hjelp av en bathophenanthroline-basert kolorimetrisk analyse
Summary
Her er det gitt en protokoll for måling av ikke-heme jerninnhold i dyrevev, ved hjelp av en enkel, veletablert kolorimetrisk analyse som lett kan implementeres i de fleste laboratorier.
Abstract
Jern er en essensiell mikronæringsstoff. Både jernoverbelastning og mangel er svært skadelig for mennesker, og vevsjernnivået er fint regulert. Bruken av eksperimentelle dyremodeller av jernoverbelastning eller mangel har vært medvirkende til å fremme kunnskap om mekanismene som er involvert i systemisk og cellulær regulering av jern homeostase. Måling av totale jernnivåer i dyrevev utføres vanligvis med atomabsorpsjonsspektroskopi eller med en kolorimetrisk analyse basert på reaksjonen av ikke-heme jern med et batofenanthroline reagens. I mange år har den kolorimetriske analysen blitt brukt til måling av ikke-heme jerninnholdet i et bredt spekter av dyrevev. I motsetning til atomabsorpsjon spektroskopi, utelukker det bidraget av heme jern avledet fra hemoglobin inneholdt i røde blodlegemer. Videre krever det ikke sofistikerte analytiske ferdigheter eller svært dyrt utstyr, og kan dermed enkelt implementeres i de fleste laboratorier. Til slutt kan den kolorimetriske analysen enten være cuvette-basert eller tilpasset et mikroplateformat, noe som gir høyere prøvegjennomstrømning. Det nåværende arbeidet gir en veletablert protokoll som er egnet for påvisning av endringer i vevsjernnivåer i en rekke eksperimentelle dyremodeller av jernoverbelastning eller jernmangel.
Introduction
Jern er en essensiell mikronæringsstoff, som kreves for funksjonen av proteiner involvert i viktige biologiske prosesser som oksygentransport, energiproduksjon eller DNA-syntese. Det er viktig at både jernoverskudd og jernmangel er svært skadelig for menneskers helse, og vevsjernnivået er fint regulert. Unormal absorpsjon av kostholdsjern, jernmangel, gjentatte blodoverføringer og kronisk betennelse er vanlige årsaker til jernrelaterte lidelser som påvirker milliarder av mennesker over hele verden1,2,3.
Eksperimentelle dyremodeller av jernoverbelastning eller mangel har vært medvirkende til å fremme vår kunnskap om mekanismene som er involvert i systemisk og cellulær regulering av jern homeostase4. Til tross for den betydelige fremgangen de siste to tiårene, er mange viktige aspekter fortsatt unnvikende. I de kommende årene vil nøyaktig måling av totale jernnivåer i dyrevev fortsatt være et kritisk skritt for å fremme forskning innen jernbiologifeltet.
De fleste laboratorier kvantifiserer vevsjern med enten atomabsorpsjonsspektroskopi (AAS), induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS), eller en kolorimetrisk analyse basert på reaksjonen av ikke-heme jern med et batofenanthroline reagens. Sistnevnte er basert på den opprinnelige metoden beskrevet av Torrance og Bothwell for over 50 år siden5,6. Mens en variasjon av denne metoden senere ble utviklet ved hjelp av ferrozin som et alternativ til badofenanthroline7, forblir sistnevnte det mest siterte kromogene reagenset i litteraturen.
Valgmetoden avhenger ofte av tilgjengelig kompetanse og infrastruktur. Mens AAS og ICP-MS er mer følsomme, forblir den kolorimetriske analysen mye brukt fordi den presenterer følgende viktige fordeler: i) den utelukker bidraget av hemejern avledet fra hemoglobin inneholdt i røde blodlegemer; ii) det krever ikke sofistikerte analytiske ferdigheter eller svært dyrt utstyr; og iii) den opprinnelige cuvette-baserte analysen kan tilpasses et mikroplateformat, noe som gir høyere prøvegjennomstrømning. Den kolorimetriske tilnærmingen som presenteres i dette arbeidet, brukes rutinemessig til å kvantifisere endringer i vevs ikke-heme jernnivåer i en rekke eksperimentelle dyremodeller av jernoverbelastning eller jernmangel, fra gnagere til fisk og fruktflue. Her er en protokoll for måling av ikke-heme jerninnhold i dyrevev gitt, ved hjelp av en enkel, veletablert, kolorimetrisk analyse som de fleste laboratorier bør finne enkle å implementere.
Protocol
Representative Results
Discussion
En protokoll for måling av ikke-heme jerninnhold i dyrevev er gitt, ved hjelp av en tilpasning av den batofenanthroline-baserte kolorimetriske analysen opprinnelig beskrevet av Torrance og Bothwell5,6. De kritiske trinnene i metoden er vevsprøvetørking; protein denaturering og frigjøring av uorganisk jern ved syrehydrolyse; reduksjon av jern (Fe3+) jern til jerntilstanden (Fe2+) i nærvær av reduksjonsmiddelet thioglykolsyre, og reaksjo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av National Funds gjennom FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., under prosjektet UIDB/04293/2020.
Materials
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
Riferimenti
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. Anemia of inflammation. Blood. 133 (1), 40-50 (2019).
- Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).
- Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
- Torrence, J. D., Bothwell, T. H., Cook, J. D. Tissue iron stores. Methods in Haematology. , 104-109 (1980).
- Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
- Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
- Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297 (2010).
- Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. Iron Absorption in Drosophila melanogaster. Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).
- Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
- Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).
