Unter Verwendung transgener fluoreszierender Mäuse werden detaillierte Protokolle beschrieben, um den axonalen Transport von Signalendosomen und Mitochondrien innerhalb motorischer und sensorischer Axone des intakten Ischiasnervs bei lebenden Tieren in vivo zu beurteilen.
Der axonale Transport erhält die neuronale Homöostase, indem er den bidirektionalen Handel mit verschiedenen Organellen und Ladungen ermöglicht. Störungen des axonalen Transports haben verheerende Folgen für einzelne Neuronen und ihre Netzwerke und tragen zu einer Vielzahl neurologischer Erkrankungen bei. Da viele dieser Bedingungen sowohl zellautonome als auch nicht-autonome Mechanismen beinhalten und oft ein Spektrum der Pathologie über neuronale Subtypen hinweg aufweisen, sind Methoden zur genauen Identifizierung und Analyse neuronaler Teilmengen unerlässlich.
Dieses Papier beschreibt Protokolle zur Beurteilung des axonalen In-vivo-Transports von Signalendosomen und Mitochondrien in Ischiasnerven von anästhesierten Mäusen. Schrittweise Anweisungen werden bereitgestellt, um 1) motorische von sensorischen Neuronen in vivo, in situ und ex vivo zu unterscheiden, indem Mäuse verwendet werden, die selektiv fluoreszierende Proteine di cholinergen Motoneuronen exprimieren; und 2) den axonalen Transport von Signalendosomen und Mitochondrien separat oder gleichzeitig in vivo beurteilen. Diese komplementären intravitalen Ansätze erleichtern die gleichzeitige Bildgebung verschiedener Ladungen in verschiedenen peripheren Nervenaxonen, um den axonalen Transport in Gesundheit und Krankheit quantitativ zu überwachen.
Das periphere Nervensystem (PNS) verbindet das zentrale Nervensystem (ZNS) mit seinen distalen Zielen, so dass die Übertragung von efferenten Signalen zur motorischen Kontrolle und afferenten Signalen zur sensorischen Rückmeldung ermöglicht wird. Unter Verwendung der Vielzahl von Fortschritten in der Mausgenetik haben Wissenschaftler verschiedene Mausmodelle entwickelt, um viele Krankheiten / Syndrome zu untersuchen, die das PNS 1,2,3 betreffen. Da die meisten neurodegenerativen Pathologien multifaktoriell mit zellautonomen und nicht-autonomen Beiträgen4,5 sind, kann das Entwirren von zell- / neuronenspezifischen Pathologien entscheidende, neuartige Einblicke in Krankheitsmechanismen liefern.
Zu diesem Zweck hat die Entwicklung von bakteriellen künstlichen Chromosomen (BAC)-transgenen Mäusen6 die selektive endogene Expression von fluoreszierenden Proteinen in gezielten Untergruppen von Neuronen ermöglicht. Zum Beispiel sind BAC-transgene Mäuse verfügbar, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) in cholinergen7 oder glycinergen Neuronen8 oder ein variantes rotfluoreszierendes Protein (tdTomato) in Parvalbumin-positiven Neuronen9 exprimieren. Alternativ kann eine selektive neuronale Expression fluoreszierender Proteine über die Cre-loxP-Technologie 10 erreicht werden. Zum Beispiel können Mausstämme, die Cre-Rekombinase in Teilmengen von Neuronen exprimieren (z. B. Cholin-Acetyltransferase (ChAT)-Cre), mit Mäusen gezüchtet werden, die ein fluoreszierendes Protein (z. B. tdTomato oder GFP) aus einem konstitutiven Ort (z. B. Gt (ROSA) 26Sor) unter der Kontrolle eines transkriptionellen Repressors exprimieren, der von loxP-Stellen11 flankiert wird (z. B. Mäuse erzeugen, die tdTomato nur in cholinergen Neuronen exprimieren). Tatsächlich wurden unter Verwendung der Cre-loxP-Rekombination transgene Mäuse erzeugt, die gelb fluoreszierendes Protein in Axonen des absteigenden kortikospinalen Traktesexprimieren 12.
Darüber hinaus ermöglichen jüngste Fortschritte in der CRISPR / Cas9-Genbearbeitung, wie ORANGE, die fluoreszierende Markierung mehrererendogener neuronaler Proteine, wobei die Expression mit nanoskaliger Auflösung 13 erreichbar ist. Darüber hinaus kann ORANGE-CAKE in Kombination mit Cre-exprimierenden Mausstämmen verwendet werden, um mehrere endogene Proteine in einzelnen Neuronen13 zu markieren. Alternativ erlaubt das viral-vermittelte neuronale Tracing auch die Markierung neuronaler Untergruppen und kann mit gezielten Kombinationen von viralen Serotypen und/oder zellspezifischen Promotoren14,15,16,17 erreicht werden.
Zusätzlich zu den neuronalen Markierungsmethoden wurden Mauslinien auch entwickelt, um Reporterproteine zu exprimieren, die auf bestimmte Organellen abzielen, wie Mitochondrien, die Cyan-Fluoreszenzprotein exprimieren (Mito.CFP)18 oder Autophagosomen, die GFP exprimieren (LC3.GFP)19. Darüber hinaus wurden Mauslinien entwickelt, um die Kalziumdynamik spezifisch in Neuronen zu bewerten (z. B. Thy1.GCaMP)20,21. Insgesamt ermöglichen neuartige experimentelle Anwendungen den Wissenschaftlern, mit der Weiterentwicklung solcher Modelle präzisere biologische und pathologische Fragen zum ZNS und PNS zu stellen.
Die Hauptaufgabe peripherer motorischer Nerven besteht darin, elektrische Signale an die Skelettmuskulatur zu übertragen, um Bewegung hervorzurufen. Darüber hinaus durchlaufen neurochemische und physiologische Nachrichten in Form verschiedener Organellen (z. B. Mitochondrien, Endolysosomen, Signalendosomen) das Zytoskelettnetzwerk uni- oder bidirektional, um die neuronale Homöostase aufrechtzuerhalten22,23,24. Beeinträchtigungen des axonalen Transports haben katastrophale Folgen für die neuronale Gesundheit und sind mit vielen neurologischen Entwicklungs- und neurodegenerativen Erkrankungen verbunden25. Auf molekularer Ebene können Beeinträchtigungen des axonalen Transports physiologische Ereignisse stören, die die synaptische Signalgebung und Plastizität, die Gentranskription und die lokale Translation im gesamten Axon regulieren26,27. Während es eine Vielzahl von Werkzeugen gibt, um diese Ereignisse in kultivierten Zellen / Neuronen zu untersuchen28, 29, sind die Beurteilung der axonalen Transportdynamik und der axonal-verknüpften biologischen Ereignisse in vivo erforderlich, um wichtige Erkenntnisse über physiologische und pathologische Prozessezu bestätigen 30.
Im Laufe der Jahre hat das Schiavo-Labor Protokolle optimiert, um verschiedene Fragen zum axonalen Transport zu stellen 31,32,33,34,35,36. Diese Experimente haben sich von der Entdeckung erweitert, dass ein fluoreszierend markiertes atoxisches Fragment von Tetanus-Neurotoxin (HCT) durch Wechselwirkungen mit Nidogen und Polysialogangliosiden37 in Axonterminals in der Skelettmuskulatur internalisiert wird. Nach der Internalisierung wird HCT rückläufig in Rab7-positive, neurotrophinhaltige Signalendosomen transportiert, die für die Zellkörper motorischer und sensorischer Neuronen bestimmt sind 38,39,40,41. Parallel dazu haben Fortschritte in der Bildgebungstechnologie die Echtzeitanalyse von peripheren Nervenbündeln und einzelnen Axonen in lebenden, anästhesiertenMäusen ermöglicht 30. Der erste Vorstoß zur Beurteilung der axonalen Transportdynamik in Pathologie in vivo ergab präsymptomatische Beeinträchtigungen des Transports von Signalendosomen und Mitochondrien im SOD1G93A-Mausmodell der amyotrophen Lateralsklerose (ALS)35. Wichtig ist, dass diese Defekte wahrscheinlich nicht einfach sekundäre Folgen der Neurodegeneration darstellen, da festgestellt wurde, dass der Verlust von Motoneuronen in Abwesenheit von axonalen Transportstörungen in einem Mausmodell der Kennedy-Krankheit42 und einem heterozygoten mutierten FUS-Modell von ALS43 auftreten kann. Solche axonalen Transportdefizite können bei ALS-Mäusen mit Inhibitoren spezifischer Kinasen33 oder Wachstumsfaktorrezeptoren34 behoben werden. Darüber hinaus verändert die Behandlung von Neuronen mit einem spezifischen Histon-Deacetylase-Blocker den mitochondrialen Transport in vivo36. Zuletzt berichteten wir, dass die BDNF-abhängige Modulation des axonalen Transports bei ALS-Mäusen44 bei verschiedenen Motoneuron-Subtypen fehlreguliert ist.
Durch die Verwendung eines ständig wachsenden Toolkits zur Bewertung der axonalen Transportdynamik28,29 skizziert dieses Videoprotokoll mehrere Anwendungen, die weitere Einblicke in verschiedene biologische und pathologische Szenarien ermöglichen. Erstens werden transgene Mäuse, die selektiv fluoreszierende Proteine in cholinergen Neuronen (d.h. Motoneuronen) exprimieren, verwendet, um sowohl in vivo als auch ex vivo zwischen motorischen und sensorischen Axonen zu unterscheiden. Fluoreszenzmarkiertes HCT wird dann in drei transgenen Linien in Signalendosomen geladen, um die axonale Transportdynamik in verschiedenen peripheren Neuronen zu differenzieren. Das nächste experimentelle Protokoll beschreibt einen Multiplex-Fluoreszenzansatz zur Beurteilung des mitochondrialen Transports speziell in Motoneuronen durch Zucht von ChAT.tdTomato-Mäusen mit Mito-CFP-Mäusen. Schließlich werden Anweisungen zur gleichzeitigen Abbildung von Mitochondrien und Signalendosomen innerhalb desselben Axons in vivo gegeben.
Dieses Protokoll beschreibt Schritte zur Beurteilung des axonalen In-vivo-Transports von Signalendosomen und Mitochondrien in intakten Axonen des Ischiasnervs der Maus. In der Tat wird ein Versuchsaufbau bereitgestellt, der es den Benutzern ermöglicht, 1) motorische von sensorischen Neuronen in vivo, in situ und ex vivo zu unterscheiden, indem sie Mäuse verwenden, die fluoreszierende Reporterproteine exprimieren, die selektiv di Motoneuronen exprimiert werden; 2) den axonalen In-vivo-Transport von Signalendosomen spezifisch in Motoneuronenaxonen mit drei verschiedenen transgenen Mäusen zu beurteilen; 3) den axonalen Transport von Mitochondrien in vivo spezifisch in Motoneuronenaxonen untersuchen; und 4) gleichzeitig die In-vivo-Transportdynamik von signalisierenden Endosomen und Mitochondrien innerhalb desselben Axons zu bewerten. Dieser Ansatz hat ein enormes Potenzial für die Untersuchung des axonalen Transports unter basalen Bedingungen und kann verwendet werden, um pathologische Störungen bei verschiedenen Krankheiten zu beurteilen, die periphere motorische und sensorische Nerven betreffen.
Unter Verwendung früherer experimenteller Paradigmen als Grundlage31,32 haben wir hier detaillierte neuartige, robuste Möglichkeiten, den axonalen Transport in motorischen und sensorischen Neuronen mit transgenen Reportermäusen zu unterscheiden. Mit der Mito.CFP-Maus wurde dieser Ansatz weiterentwickelt, um den mitochondrialen Transport in vivo zu beurteilen, indem intraziatische Nerveninjektionen von TMRE36 vermieden wurden. Dadurch werden mögliche neuronale Schäden und Störungen im axonalen Transport umgangen, die durch die intranerväre Injektion der Sonde verursacht werden. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll die Visualisierung des axonalen Transports mehrerer Organellen in motorischen Axonen, die Muskeln mit ausgeprägten physiologischen Eigenschaften innervieren (z. B. schnell zuckende ermüdungsresistente Muskeln vs. langsam zuckende, ermüdungsresistente Muskeln). So kann die Signalisierungsendosomen- und/oder mitochondriale axonale Transportdynamik in verschiedenen Untergruppen von α-Motoneuronen44 beurteilt werden. Darüber hinaus kann der axonale Transport dieser Organellen in pathologischen Umgebungen auch durch Kreuzung mit Mausmodellen verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen beurteiltwerden 1,2,3.
Das axonale Transport-Toolkit wird kontinuierlicherweitert 28,29, und es wurden Ex-vivo-Protokolle entwickelt, um die Transportdynamik mit kultivierten ventralen Maushornexplantaten 49 oder ausgeschnittenen Mausnerven-Muskel-Präparaten50 zu bewerten. Darüber hinaus hat die Entwicklung von Protokollen zur Beurteilung des axonalen Transports in induzierten humanen pluripotenten Stammzellen (hiPSC)-abgeleiteten kortikalen51-Neuronen oder hiPSC-abgeleiteten spinalen Motoneuronen52 die Untersuchung menschlicher Neuronen mit krankheitsverursachenden Mutationen ermöglicht. Solche hochmodernen Protokolle in Mausgewebe und menschlichen Zellen können kritische Einblicke in die neuronale Funktion liefern, neuartige pathomechanistische Entdeckungen in neurodegenerativen Krankheitsmodellen erleichtern und zum Testen therapeutischer Moleküle und Strategien verwendet werden.
Für die erfolgreiche Implementierung dieser Techniken müssen mehrere kritische Schritte befolgt werden, und im Protokollabschnitt wurden einige wichtige Hinweise gegeben. Die wichtigsten Anforderungen an die intravitale Bildgebung sind das inverse konfokale Mikroskop mit kundenspezifischem Tischeinsatz und die Ausrüstung zur Aufrechterhaltung der Anästhesie und der optimalen Temperatur. In der Tat ist ein spezialisiertes mobiles Anästhesiesystem für 1) Induktion der Anästhesie, 2) Dissektion / Gewebeverarbeitung (dh Freilegung des Ischiasnervs) und 3) Aufrechterhaltung der Anästhesie während der intravitalen Bildgebung (wie zuvor in 31,32 beschrieben) erforderlich. Insbesondere bei Verwendung höherer Vergrößerungsobjektive (z. B. 40x oder 63x) kann die Tiefe der Anästhesie die Bildqualität beeinflussen, da eine tiefere Anästhesie große “keuchende” Atemzüge induziert, die zu häufigen Fokusverschiebungen führen. Solche großen Bewegungen werden sich zweifellos auf die Transportanalysen nach der Bildgebung auswirken (z. B. die Verfolgung von Ladungen mit den Fidschi-Plugins TrackMate53 oder KymoAnalyzer54), da die Atembewegungen Artefakte in Zeitraffervideos erzeugen, die sie für die automatisierte Verfolgung ungeeignet machen können oder eine zeitaufwändigere Bewertung erfordern. Darüber hinaus haben wir auch bildgebende Artefakte beobachtet, die durch pulsierende Arterien im Ischiasnerv verursacht werden, die nur durch die Wahl einer anderen Bildgebungsregion aufgelöst werden können. Das Mikroskop muss mit einer Umgebungskammer ausgestattet sein, die in der Lage ist, eine konstante Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, da Temperatur und pH-Wert den axonalen Transport beeinflussen55. Darüber hinaus sollte die Anwendung von Analgetika nach der Operation vermieden werden, da sie die Transportdynamik verändern können56. Wenn das experimentelle Design längsschnittlich ist und eine wiederholte Bildgebung erfordert (z. B. 57), müssen die Dissektionsprotokolle entsprechend angepasst werden, um minimal-invasiv zu sein, und erfordern möglicherweise eine zusätzliche ethische Genehmigung / Lizenzgenehmigung.
Bestimmte experimentelle Überlegungen müssen im Auge behalten werden. Erstens beinhalten die meisten der hier beschriebenen Protokolle die Verwendung von transgenen Mäusen, die fluoreszierende Reporterproteine in Mitochondrien oder Motoneuronenaxonen besitzen. Jede dieser Mauslinien sollte als Hemi-/Heterozygote gezüchtet und abgebildet werden. Die Ausnahmen sind jedoch die ChAT.Cre- und Rosa26.tdTomato-Mauslinien, die separat als Homozygoten beibehalten werden können, wobei die resultierenden hemizygoten Nachkommen die tdTomato-Expression in cholinergen Neuronen nach Cre-loxP-Rekombination ermöglichen. Bei der Kreuzung transgener Hemi-/heterozygoter Mäuse (z. B. Mito.CFP) mit anderen transgenen Hemi-/heterozygoten Mäusen (z. B. ChAT.eGFP) muss die Zuchtstrategie sorgfältig geprüft werden, da die Ermittlung der gewünschten Anzahl von Nachkommen mit doppelter Mutante zeitaufwändig sein kann. Darüber hinaus sollte man bei der Züchtung der F1-Generation von ChAT.Cre- und Rosa26.tdTomato-Mäusen (d.h. ChAT.tdTomato) mit zusätzlichen transgenen Stämmen (z.B. Mito.CFP) noch weniger Mäuse erwarten, die die gewünschten dreifachen Transgene tragen. Darüber hinaus muss man auch die potenzielle Fluorophorüberlappung berücksichtigen, wenn Zwei-Reporter-Mäuse mit nahe gelegenen Wellenlängeneigenschaften gezüchtet werden (z.B. Mito-CFP-Anregung: 435 nm, Emission: 485 nm, gezüchtet mit ChAT.eGFP-Anregung: 488 nm, Emission:510 nm), obwohl es möglich sein könnte, dieses Problem mit spektraler Entmischung 58 zu überwinden.
Diese Technik hat einige Einschränkungen, die berücksichtigt werden müssen. In dieser Arbeit und unseren früheren Protokollen31,32 haben wir gezeigt, wie mehrere genetisch kodierte Marker und verschiedene Färbemethoden verwendet werden können, um verschiedene Organellen in vivo zu markieren und zu verfolgen. Allerdings sind nicht alle Sonden für diesen experimentellen Ansatz geeignet. Wir untersuchten Injektionen in TA oder Soleusmuskel der Choleratoxin-beta-Untereinheit (CTB)-488 (0,5-1,5 μg/μL ~4 h vor der Bildgebung), einer Sonde, die routinemäßig zur Markierung von Motoneuronzellkörpern in in vivo retrograden Tracer-Experimenten59,60 verwendet wird. Wenn sie jedoch allein injiziert oder mit HCT-555 co-injiziert wurde, war die CTB-488-Markierung schlecht, obwohl Konzentrationen verwendet wurden, die denen für eine erfolgreiche retrograde Motoneuronenverfolgung ähnlich waren. Daher kommen wir zu dem Schluss, dass, obwohl CTB ein ausgezeichneter In-vitro-Marker für signalisierende Endosomen in neuronalen Kulturenist 61, HCT die Goldstandardsonde bleibt, um signalisierende Endosomen in vivo in Ischiasnervaxonen zu identifizieren.
Auf verschiedenen Routen testeten wir auch Sonden, die routinemäßig zur Markierung von Lysosomen verwendet werden, wie LysoTracker grün DND-26, und Marker aktiver lysosomaler Hydrolasen wie BODIPY-FL-Pepstatin A für Cathepsin D62 und Magic Red für Cathepsin B, jedoch ohne Erfolg. Wir versuchten die intramuskuläre Verabreichung von BODIPY-FL-Pepstatin A (2,5 μg in die TA ~4 h vor der Bildgebung) sowie die intrainziatorische Nerveninjektion von 2 μL LysoTracker (10 μM), BODIPY-FL-pepstatin A (10 μM) oder Magic Red (1/10) 30-60 min vor der Bildgebung. Trotz dieser Sonden, die den Nerv hervorhoben, konnten wir keine eindeutig gekennzeichneten Organellen finden. Die Sonden sammelten sich um Axone an und wurden wahrscheinlich von Schwann-Zellen zurückgehalten. Daher kann die erfolglose Markierung von Lysosomen auf eine mangelhafte Sondenabgabe in Neuronen zurückzuführen sein, obwohl das Vorhandensein geeigneterer Konzentrationen nicht ausgeschlossen werden kann. Da die TMRE-Markierung unter ähnlichen Bedingungen funktioniert (d. h. intraziatische Nerveninjektionen), kann die Markierungsintensität farbstoffabhängig sein und muss für jeden Marker unabhängig getestet werden. Wir kommen jedoch zu dem Schluss, dass das Targeting von Lysosomen in vivo mit diesen Sonden bei den oben genannten Konzentrationen nicht möglich ist.
Anästhesiemethoden können unterschiedliche physiologische Auslesungen verändern (z. B. Cochlea-Funktion63 und kortikale Elektrophysiologie64); Ob die Anästhesie jedoch den axonalen Transport im Ischiasnerv in vivo beeinflusst, ist derzeit nicht bekannt. Angesichts der reduzierten neuromuskulären Aktivität unter Isofluran-induzierter Anästhesie ist es möglich, dass sich die Transportkinetik im Vergleich zum Wachzustand unterscheidet. Die einzige In-vivo-Studie, die dies direkt untersucht hat, ergab jedoch, dass sich der Transport von dichten Kernvesikeln in thalamokortikalen Projektionen zwischen anästhesierten und wachen Mäusennicht unterscheidet 65. Da Unterschiede im Transport zwischen Wildtyp- und Krankheitsmodellmäusen unter Narkose35,43 nachweisbar sind, ist es außerdem klar, dass die Isofluran-Exposition die Identifizierung von Perturbanen bei der Signalübertragung von Endosomen- oder Mitochondrienverkehr nicht verhindert.
Dieses Protokoll hat andere potenzielle Anwendungen, die im Folgenden beschrieben wurden. Die Züchtung der in diesem Protokoll beschriebenen transgenen Mäuse (z. B. Mito.CFP, ChAT.eGFP) mit den Mausmodellenfür neurodegenerative Erkrankungen 1,2,3 ermöglicht neuronensubtyp- und/oder frachtspezifische Untersuchungen. Darüber hinaus würden kürzlich entwickelte Cre-Linien66 der Maus auch die Visualisierung von fluoreszierenden Reporterproteinen in verschiedenen sensorischen Axonpopulationen ermöglichen. Zum Beispiel können Rosa26.tdTomatenmäuse mit einem Neuropeptid Y-Rezeptor-2-exprimierend (Npy2r) gekreuzt werden. Cre-Maus zur Aktivierung der tdTomato-Fluoreszenz in myelinisierten A-Faser-Nozizeptoren67. Darüber hinaus kann die zeitliche Kontrolle auch durch den Einsatz induzierbarer Cre-Systeme (z. B. Tamoxifen) erreicht werden68. Eine weitere mögliche Anwendung beruht auf der Verfügbarkeit von transgenen Mäusen, die fluoreszierende Reporterproteine in Schwann-Zellen exprimieren. Tatsächlich ermöglichen S100-GFP 69- undPLP-GFP 70-Mäuse In-vivo– und/oder In-situ-Bildgebung von Schwann-Zellen und stehen an der Spitze der Forschung, die an der Migration von Schwann-Zellen während der peripheren Nervenregeneration beteiligt ist.
Zusätzlich zu diesen Anwendungen und ergänzend zur Mito.CFP-Maus ist die Verfügbarkeit mehrerer transgener Mauslinien, die fluoreszierende Proteine in verschiedenen Organellen wie Mitochondrien und Autophagosomen exprimieren. Zum Beispiel könnte die Untersuchung des mitochondrialen Transports in vivo mit der mito::mKate2 Maus71 oder der photokonvertierbaren mitoDendra Maus57 möglich sein. Darüber hinaus kann ein In-vivo-Mitophagosomentransport mit der pH-sensitiven Mito-Keima-Maus72 und der Mito-QC-Maus73 für mitophagische Analysen möglich sein. Darüber hinaus können die lysosomalen Markierungsschwierigkeiten, auf die wir gestoßen sind, durch die Verwendung von Mäusen, die LAMP1-GFP exprimieren, überwunden werden, mit dem Vorbehalt, dass LAMP1 auch in endokytischen Organellen vorhanden ist, die sich von Lysosomen74 unterscheiden.
Zusammenfassend haben wir neue Wege aufgezeigt, um den axonalen Transport mehrerer Organellen in bestimmten peripheren Nervenaxonen von verschiedenen transgenen Mäusen in vivo zu beurteilen. Die gleichzeitige Bildgebung verschiedener Organellen wird angesichts der jüngsten Erkenntnisse über axonale Wechselwirkungen und den gemeinsamen Handel mit Organellen wie Mitochondrien und Endosomen besonders wichtig sein75,76. Wir glauben, dass die vorgestellten Methoden nützlich sein werden, um das Verständnis der Basalphysiologie von Axonen in vivo zu verbessern und wichtige Pathomechanismen zu entwirren, die die Neurodegeneration peripherer Nerven vorantreiben.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Robert M. Brownstone (Queen Square Institute of Neurology, University College London) für die gemeinsame Nutzung der ChAT-eGFP-, ChAT.Cre- und Rosa26.tdTomato-Mäuse sowie Pietro Fratta (Queen Square Institute of Neurology, University College London) für die gemeinsame Nutzung des HB9. GFP-Maus. Wir danken Elena R. Rhymes, Charlotte J.P. Kremers und Qiuhan Lang (Queen Square Institute of Neurology, University College London) für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Junior Non-Clinical Fellowship der Motor Neuron Disease Association (UK) (Tosolini/Oct20/973-799) (APT), die Wellcome Trust Senior Investigator Awards (107116/Z/15/Z und 223022/Z/21/Z) (GS), einen Preis der UK Dementia Research Institute Foundation (GS); und einen Medical Research Council Career Development Award (MR/S006990/1) (JNS).
0.2 mL PCR tube | |||
70% (v/v) ethanol in distilled water | |||
AlexaFlour555 C2 maleimide | ThermoFisher Scientific | A-20346 | Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide |
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J | Jackson Laboratory | 7909 | Rosa26.tdTomato mice |
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice | Jackson Laboratory | 5029 | HB9.GFP mice |
B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice | Jackson Laboratory | 7967 | Mito.CFP mice |
B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice | Jackson Laboratory | 6410 | ChAT.Cre mice |
Computer with microscope control and image acquisition software | Zeiss | Zen | |
Cotton swab | |||
Desktop centrifuge | |||
Dissecting microscope | |||
Eye lubricant | |||
Fine curved forceps | Dumont | ||
Fine straight forceps | Dumont | ||
Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1) | |||
Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | |
Hair clippers | |||
Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) | Merck | 20779 | |
HcT-441 | N/A | N/A | See Restani et al., 2012 for more details |
Heating pad | |||
Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C | |||
Inverted confocal microscope with environmental chamber | Zeiss | LSM 780 | Most inverted confocals should be adaptable |
Isoflurane | |||
Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer | |||
Magic tape | invisible tape | ||
Micropipette puller | |||
Parafilm | Parafilm | ||
Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4 | |||
Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | BDNF that can be used to co-inject with HcT-555 |
Saline | |||
Scalpel blade | Dumont | ||
Small spring scissors | Dumont | ||
Surgery/operating microscope | |||
Surgical drape | |||
Surgical suture | |||
Surgical tape | |||
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice | MMRRC | 000296-UCD | ChAT.eGFP |
Vortex mixer |