Snijden van de embryonale kip auditieve hersenstam om tonotopische gradiënten en microcircuits te evalueren

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van niet-coronale auditieve hersenstamschijfjes van het kippenembryo voor het onderzoek naar tonotopische eigenschappen en ontwikkelingstrajecten binnen één hersenstamsegment. Deze segmenten omvatten sagittale, horizontale en horizontale / transversale secties die grotere tonotopische gebieden omvatten binnen een individueel segmentvlak dat de traditionele coronale secties omvat.

Abstract

Het kippenembryo is een algemeen geaccepteerd diermodel om de auditieve hersenstam te bestuderen, samengesteld uit zeer gespecialiseerde microcircuits en neuronale topologie differentieel georiënteerd langs een tonotopische (d.w.z. frequentie) as. De tonotopische as maakt de gescheiden codering van hoogfrequente geluiden in het rostrale mediale vlak en laagfrequente codering in caudo-laterale gebieden mogelijk. Traditioneel maken coronale hersenstamschijfjes embryonaal weefsel de studie van relatieve individuele iso-frequentie lamina mogelijk. Hoewel voldoende om anatomische en fysiologische vragen met betrekking tot individuele isofrequentiegebieden te onderzoeken, is de studie van tonotopische variatie en de ontwikkeling ervan in grotere auditieve hersenstamgebieden enigszins beperkt. Dit protocol rapporteert hersenstam-snijtechnieken van kippenembryo’s die grotere gradiënten van frequentiegebieden in de lagere auditieve hersenstam omvatten. Het gebruik van verschillende snijmethoden voor kippenorthorisch hersenstamweefsel maakt elektrofysiologische en anatomische experimenten binnen één hersenstamsegment mogelijk, waarbij grotere gradiënten van tonotopische eigenschappen en ontwikkelingstrajecten beter bewaard blijven dan coronale secties. Meerdere snijtechnieken maken een beter onderzoek mogelijk naar de diverse anatomische, biofysische en tonotopische eigenschappen van auditieve hersenstammicrocircuits.

Introduction

Het kippenembryo is een waardevol onderzoeksmodel om fundamentele biologische vragen te bestuderen op tal van en diverse wetenschappelijke gebieden, waaronder celbiologie, immunologie, pathologie en ontwikkelingsneurobiologie. Het microcircuit van de auditieve hersenstam van de kip is een uitstekend voorbeeld van een zeer gespecialiseerd circuit dat kan worden begrepen in termen van auditieve morfologie en fysiologie. Rubel en Parks (1975) beschreven bijvoorbeeld voor het eerst de tonotopische oriëntatie (d.w.z. frequentiegradiënt) van de kippenkern magnocellularis (NM) en nucleus laminaris (NL) als een lineaire functie over de as van de kernen, georiënteerd ~ 30 ° ten opzichte van het sagittale vlak. Individuele neuronen in NM en NL coderen hun beste geluidsfrequentie – bekend als hun karakteristieke frequentie (CF) – langs het rostrale mediale vlak naar het caudo-laterale gebied. Hoogfrequent gevoelige neuronen bevinden zich in het rostrale mediale gebied en laagfrequentgevoelige neuronen bevinden zich caudo-lateraal. Als zodanig hebben traditionele dissectiemethoden van auditief hersenstamweefsel om tonotopische eigenschappen te bestuderen opeenvolgende coronale plakjes gebruikt. Inderdaad, auditieve microcircuits van zich ontwikkelende kippenembryo’s zijn vastgesteld als een modelsysteem voor het bestuderen van signaalverwerking van tonotopische auditieve functies door opeenvolgende caudale-naar-rostrale coronale vlak hersenstamsneden gedurende tientallen jaren 1,2,3,4,5,6.

De tonotopische organisatie van NM en NL is echter topologisch en morfologisch ingewikkeld. Gehoorzenuwinputs worden zodanig verdeeld dat hoge CF-ingangen eindigen in endbulb-achtige structuren die ten minste een kwart van de somatische omtrek van een adendritische NM-cel bedekken. Omgekeerd zijn lage CF-ingangen niet georganiseerd met eindbolachtige terminals, maar met meerdere bouton-synapsen op dendrieten van NM-neuronen. Middelste CF-ingangen eindigen als zowel eindlamp als bouton-achtige synapsen 4,7,8,9,10,11,12. In NL is de sterk stereotiepe dendritische gradiënt niet alleen zichtbaar in de dendritische lengte, maar ook in de dendritische breedte. Deze unieke dendritische gradiënt sluit nauw aan bij de tonotopische as. De dendrieten ondergaan een 11-voudige toename in lengte en een vijfvoudige toename in breedte van respectievelijk hoge naar lage CF-neuronen^{, respectievelijk 6}. Om dergelijke ingewikkelde verdelingen van deze kernen in coronale segmenten te overwinnen, beschrijft dit protocol dissectiebenaderingen in de sagittale, horizontale en horizontale / transversale vlakken. Deze snijtechnieken bieden voorbeelden van auditief hersenstamweefsel dat maximale tonotopische eigenschappen vertoont in een individueel snijvlak.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door northwestern University Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) en werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals. De protocollen voor dissectie en voorbereiding van hersenstamweefsel zijn in overeenstemming met eerdere protocollen 5,13. 1. Eieren hanteren Koop bevruchte eieren (Gallus gallus domesticus) bij een IACUC-goedgekeurde lokale dierenleverancier. Bewaar de eieren direct bij aankomst in de koelkast bij 14 °C en broed binnen 5 dagen uit.OPMERKING: De levensvatbaarheid van het embryo neemt na 1 week aanzienlijk af. Steriliseer de eieren met 70% ethanol vóór incubatie bij 38 ± 1 °C en ~50% vochtigheid. 2. Kunstmatige cerebrale-spinale vloeistof (ACSF) samenstelling en voorbereiding Meng de volgende chemicaliën in 1 L van 18,2 MΩcm dH2O om een 10x ACSF stockoplossing te creëren: NaCl (natriumchloride) 130 mM, NaHCO3 (natriumbicarbonaat) 26 mM, KCl (kaliumchloride) 2,5 mM, NaH2PO4 (natriumdiwaterstoffosfaat) 1,25 mM, dextrose (D-(+)-glucose) 10 mM. Bewaar de bouillonoplossing in de koelkast. Bereid MgCl2 (magnesiumchloride) 1 M en CaCl2 (calciumchloride) 1 M oplossingen afzonderlijk in 18,2 MΩcm dH2O en bewaar in de koelkast. Verdun vlak voor gebruik 10x ACSF tot 1x en bel continu met 95% O2/5% CO2 gedurende 15-20 min en voeg MgCl2 en CaCl2 toe. Om ACSF en dACSF (het ontleden van ACSF) te bereiden, moet u zich aanpassen aan een eindconcentratie van respectievelijk Mg2+ 1 mM, Ca2+ 3 mM en Mg2+ 3 mM, Ca2+ 1 mM. Stel de borrelsnelheid voor de ACSF zo in dat de pH 7,2-7,4 is met een osmolaliteit tussen 300 en 310 mOsm/L.OPMERKING: Het laten plaatsen van de ACSF in een ijsbad tijdens het borrelen is gunstig voor het handhaven van een lage oplossingstemperatuur, die de structurele integriteit van het weefsel ondersteunt tijdens het ontleden. 3. Agarose (5%) blokvoorbereiding Meng 5 g agarose in 100 ml dACSF. Gebruik een waterbad of magnetron van 100 °C gedurende 2-3 minuten, roer om de 30 s om klontjes te voorkomen totdat de agarose volledig oplost en begint te borrelen. Giet de gesmolten agarose in een lege petrischaal tot 5 mm dikte en bewaar op kamertemperatuur om in te stellen. Sluit na het instellen de petrischaal af met parafilm en bewaar bij 4 °C. Snijd de agarose in kubusvormige blokken met een scherp mes en gebruik ze op het moment van dissectie. 4. Dissectieprotocol en isolerende auditieve hersenstam Reinig het dissectiegebied met 70% ethylalcoholoplossingspray. Lijm het ondersteunende of schuine agaroseblok op de vibratomebak. Kies eieren van de gewenste leeftijd (E20 en E21 in dit protocol). Behandel en incubeer de eieren volgens de hierboven vermelde protocollen zoals in stap 1. Lokaliseer de met lucht gevulde ruimte door het ei onder een fel licht (candling) te plaatsen en deze ruimte aan de grotere of rondere kant van het ei te zoeken. Acclimatiseer de eieren aan kamertemperatuur, kraak de schaal over de met lucht gevulde ruimte en stel de membraanzak bloot. Maak een zachte incisie in de zak om de snavel bloot te leggen. Trek met een scalpel voorzichtig de nek en het hoofd uit het ei. Snel onthoofdt u het hoofd met een scherpe schaar. Reinig na onthoofding het hoofd met ijsgekoelde dACSF om overtollig bloed uit het dissectiekussen te verwijderen. Houd het hoofd stabiel in ijsgekoelde dACSF en maak een rostro-caudale incisie. Start de incisie achter en tussen de ogen en volg de lengte van de geoogste nek.OPMERKING: Jongere embryo’s kunnen minder druk nodig hebben tijdens het maken van de incisie. Scheid de huid om de schedel bloot te leggen. Knip de schedel achter het oog in een middellijn naar laterale richting. Doe dit voor beide hemisferen.OPMERKING: Deze stap helpt het rostrale deel van de schedel te scheiden van de aangehechte hersenen terwijl het hersenweefsel intact blijft5. Snijd het rostrale deel van de schedel in plakjes. Plaats het mes achter de ogen en maak een snelle snede.OPMERKING: Inspanning kan nodig zijn om de bijgevoegde schedel schoon te snijden. Dompel het hoofd onder in een schaal van koude dACSF. Maak met behulp van een kleine schaar middellijn tot laterale incisies in het caudale gebied van de schedel om te proberen de hersenen van de schedel te scheiden zonder weefselschade te veroorzaken. Leg de hersenstam en het cerebellum voorzichtig bloot. Trek het dorsale gebied van de hele schedel in, verwijder de hersenstam voorzichtig en leg het bloot met behulp van een fijne kwast met milde sleeën. Gebruik een gebogen tang om de hersenstam te reinigen van verbindend weefsel en bloedvaten. Besteed extra aandacht aan het8e hersenzenuwgebied en zorg ervoor dat u aan beide zijden een korte lengte van intacte zenuwvezels achterlaat. Scheid de hersenstam van het cerebellum door de steeltjes af te snijden en de bloedvaten voorzichtig te verwijderen. Trim de hersenstam van extra bloedvaten.OPMERKING: Zorg ervoor dat de hele procedure wordt uitgevoerd in ijsgekoelde dACSF continu bubbeld met carboxygeen (95% O2/5% CO2). 5. Vibratome snijden OPMERKING: In de volgende stappen moet de achterkant van het weefsel worden ondersteund met een kubusvormig stuk agarose. Plaats het vibratriumblad langs de horizontale as en lijm de hersenstam op een snijbak. Lijm de rostrale kant en houd de rostrale-caudale as verticaal voor coronale plakjes.Houd de lateraal-mediale as verticaal voor sagittale plakjes. Lijm de ventrale kant en houd de dorsaal-ventrale as verticaal voor horizontale plakjes. Om het acute hoekige sagittale-horizontale vlak te bereiken, lijmt u de ventrale kant van de hersenstam en houdt u de ventrale-dorsale as verticaal op het hypotenusaoppervlak van het agaroseblok, dat in een hoek van 45 ° is gesneden. Lijm het tegenoverliggende oppervlak van het agarose-blok tegenover de snijbak en houd de rostrale-caudale as evenwijdig aan de bladrand. 6. Omgaan met fragiele of grote stukken hersenstamweefsel In een alternatieve benadering van stap 5 dompel je de geïsoleerde hersenstam onder in 4% laag smeltpunt (LMP) agarose bij ~40 °C in een petrischaaltje van 35 mm x 10 mm.Nadat je agarose op de ondergedompelde hersenstam hebt gegoten, plaats je de petrischaal op ijs om te stollen. Snijd het kubusvormige agaroseblok met ingebedde hersenstam met behulp van een scherp scheermesje. Lijm het LMP-agaroseblok aan de rostrale kant en houd de rostrale-caudale as van de hersenstam verticaal.Neem coronale plakjes totdat het NM-gebied kan worden gevisualiseerd. Verwijder het agaroseblok van de lijm met een scherp mes. Om de kernen te herkennen, plaatst u voorzichtig 0,5 μL kleurstof (toluidineblauw of oranje G) op de NM met een fijne naald. Monteer dit blok opnieuw op de snijbak voor sagittale of horizontale plakjes en identificeer de kernen met betrekking tot het gekleurde gebied. Voor de beste prestaties stelt u de snijsnelheid van het vibratoom in op 4 – 5 (~ 30 ± 4 mm / min), de trilfrequentie op 85-87 Hz en de snijamplitude op 4-6 (~ 1 ± 0,2 mm). Plaats na hersenstamsectie de 200-300 μm sequentieel verzamelde plakjes in een in de handel verkrijgbare plakkamer om gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in ACSF te balanceren, continu bubbeld met een mengsel van 95% O2/5% CO2 (pH 7,2-7,4, osmolariteit 300-310 mOsm/L). In deze omstandigheden blijven plakjes levensvatbaar tot 5-6 uur. 7. Elektrofysiologie: patchklemprocedure Breng een hersenstamsegment over naar de opnamekamer met continue perfusie van gecarboneerde ACSF ~ 1,5 ± 0,5 ml / min. Trek patchpipetten met een micropipettetrekker met een tipdiameter van 1-2 μm en weerstand in het bereik van 3-6 MΩ.Pipetten vullen met een interne oplossing op basis van K-gluconaat (voor stroomklemregistratie). Om de neuronale eigenschappen in de verschillende tonotopische regio’s binnen een segment te testen, lokaliseer je neuronen aan beide uiteinden van het segmentvlak en benader je met de opname-elektrode. Handhaaf positieve luchtdruk aan de pipetpunt terwijl u een neuron nadert. Ga naar de soma toe totdat een inkeping op het neuron wordt gevisualiseerd. Voer de volgende twee stappen snel uit. Maak een gigaohm (1 GΩ) afdichting door positieve luchtdruk los te laten. Houd de versterkerinstelling in de spanningsklemmodus en corrigeer de pipetverschuiving als nul pA. Voer een afdichtingstest uit (10 mV testpuls bij 100 Hz). Breng negatieve luchtdruk aan om een klein stukje van het neuronale membraan te scheuren. Om de actieve intrinsieke eigenschappen van auditieve neuronen te testen, past u hyperpolariserende en depolariserende somatische stroominjecties toe.OPMERKING: Voorbeelden van deze procedure kunnen worden gevisualiseerd in Aanvullende video S1, S2. Details van deze procedure zijn te vinden in de videolegendes.

Representative Results

Alle hier getoonde hersenstamsegmenten werden verkregen uit hersenstamweefsel (~ 200-300 μm) en in beeld gebracht met behulp van een 5x objectief en differentieel interferentiecontrast (DIC) optica. De camera werd op de ontleedmicroscoop gemonteerd en aangesloten op een computer met beeldacquisitiesoftware (zie Materiaalopgave). Satellietinzet voor deze figuren (rechterpanelen) werd in beeld gebracht met behulp van een 60x vergrotingswaterdompelingsobjectief. Er werd voor gezorgd dat alle gebieden van de hersenstamstrook even groot werden gemaakt tijdens het verkrijgen van digitale beelden. Foto’s werden gemaakt met optimale helderheid en focus. De digitale afbeeldingen van hersenstamsegmenten werden op een vlakke manier gestikt op basis van overlappend gebied en geïmporteerd naar een desktopcomputer voor verdere aanpassingen van helderheid, contrast en grijswaarden. De basismicrocircuits van de auditieve hersenstam van de kip werden geïdentificeerd volgenseerder werk 1,2,5,13. Onder de microscoop (5x objectief) werden auditieve kernen geïdentificeerd als het gebied dat grenst aan de zwaar gemyeliniseerde zenuwvezels die rond elke kern lopen, zowel ipsilateraal als contralateraal langs de dorsale gebieden van de plak. Figuur 1 toont de traditionele coronale delen van hersenstamweefsel (200-300 μm) van een E21 kippenembryo. De vier hier getoonde coronale segmenten vertegenwoordigen de relatieve isofrequentiegebieden van de auditieve hersenstamkernen, van het minst-CF auditieve gebied (figuur 1A, caudo-lateraal) dat doorgaat naar het hoogste CF auditieve gebied (figuur 1D, rostral-mediaal). Voor alle vier de coronale segmenten in figuur 1A-D worden vergrote gebieden van gelabelde NM en NL weergegeven in de middelste kolom en vergroot (60x objectief) op het rechterbeeld van het figuurpaneel (respectievelijk a en b in satellietinzetstukken). De pijl in figuur 1A,B toont de invoer van gehoorzenuwvezels en de pijlpunt toont de splitsing van NM-axonen aan de linkerkant van de plak. Figuur 1C toont een andere aviaire cochleaire kernstructuur die bekend staat als nucleus angularis (NA, pijl links en pijlpunt rechts). De twee meest rostrale coronale plakjes tonen de superieure olivaire kern (SON) langs het ventrale laterale gebied van de coronale plak (figuur 1C, D, witte stippelcirkels). Figuur 2 toont sagittale delen van hersenstamweefsel (200-300 μm) van een E21 kippenembryo. Voor alle drie de sagittale segmenten (figuur 2A-C) worden vergrote gebieden van gelabelde NM en NL weergegeven in de middelste kolom en vergroot (60x objectief) op het rechterbeeld van het figuurpaneel (respectievelijk a en b in satellietbeelden). NM en NL werden geïdentificeerd waar de gehoorzenuwvezels (figuur 2A, middelste pijl) het cluster van neuronen binnendrongen dat bij een hogere vergroting werd waargenomen (figuur 2A, middelste, kleine, witte stippelcirkels en pijlpunten) en het startpunt van het auditieve gebied benadrukt (figuur 2A, links, grote, witte stippelcirkel en pijlpunt). SON werd geïdentificeerd in het laterale gebied van de meest laterale plak (figuur 2A, kleine, witte, onderbroken cirkel). Figuur 2B toont uitgebreide tonotopische gebieden die zowel relatief lage als hoge CF auditieve gebieden van NM en NL langs de rostrale-caudale as bevatten (wit omlijnde gebieden, zie ook satellietinzet ). Figuur 2C toont de ipsilaterale en contralaterale axonale plukjes in de meest mediale plak en het eindpunt van het auditieve gebied (linker- en middelste pijlen). De oriëntatie van de hier getoonde segmenten contrasteert met de traditionele oriëntatie van segmenten zoals te zien in figuur 1 (d.w.z. coronaal). Dit werd uitgevoerd om de oriëntatie weer te geven die het beste past bij de benadering van een glazen pipet die nodig is voor elektrofysiologische opnames. Om te bevestigen dat een groot gebied van de tonotopische as was weergegeven in figuur 2B, werden stroomklem elektrofysiologische opnames uitgevoerd van NM-neuronen. Figuur 3 toont functionele overeenkomsten en verschillen van volwassen (E21) NM-neuronen geregistreerd uit een coronale plak (figuur 3A, B) en een sagittale plak (figuur 3C, D, aanvullende video S1, S2). Twee NM-neuronen werden geselecteerd uit de mediale en laterale uiteinden van een coronale plak (vergelijkbaar met de plak in figuur 1B), en twee NM-neuronen werden geselecteerd uit de rostrale en caudale uiteinden van NM in een sagittale plak (zoals in de plak weergegeven in figuur 2B). Figuur 3A,B toont vergelijkbare elektrofysiologische responseigenschappen op somatische stroominjecties (−100 pA tot +200 pA, +10 pA stappen, 100 ms duur). Het vuurpatroon van deze twee NM-neuronen vertoont subtiele verschillen in dit plakvlak, wat wijst op relatieve iso-frequentie lamina voor middenfrequente NM-neuronen. Figuur 3C,D laat zien dat de vuurpatronen substantiële verschillen hebben over de rostrale-caudale as, wat wijst op een relatief hogere tonotopische gradiënt van een laagfrequent NM-neuron (figuur 3C) naar een hoogfrequent NM-neuron (figuur 3D). Beide neuronen presenteerden zich met hun stereotiepe vuurpatronen zoals eerder gemeld 14,15. Figuur 4 toont horizontale delen van hersenstamweefsel (200-300 μm) van een E21 kippenembryo. Voor beide horizontale segmenten (figuur 4A,B) worden vergrote gebieden van gelabelde NM en NL weergegeven in de middelste kolom en vergroot (60x objectief) op de rechterkant van het figuurpaneel (respectievelijk a en b in satellietinzetstukken). In de horizontale segmenten werden NM en NL geïdentificeerd in de richting van de middellijn en neuronen werden verspreid langs de lateraal-mediale as (figuur 4A, B, middelste, witte, onderbroken omtrekgebieden). De vergrote beelden tonen de grote omvang van het tonotopische verloop. Laagfrequente neuronen bevinden zich in de caudo-laterale regio’s en hoogfrequente neuronen bevinden zich in de rostrale mediale gebieden (figuur 4A, B, rechts, satellieten). De vezels die door de middellijn langs de rostrale-caudale as lopen, tonen de contralaterale verbindingen van de auditieve kernen, maar de organisatie van deze vezels bevindt zich niet in een eenvoudig vlak. Acute hoekige plakjes uit een horizontale /transversale sectie kunnen deze axonale vezels echter volgen naar het sagittale vlak. Plakjes van 200-300 μM dik hersenstamweefsel in een acute hoek (45°) van een horizontaal vlak zijn weergegeven in figuur 5. Auditieve hersenstamkernen zijn te zien over een grote diagonale spread die begint bij de meest laterale plak en eindigt bij de meest mediale plak (figuur 5A-C, gelabelde middenpanelen, wit omlijnd gebied). Bovendien kan de hoekoriëntatie van NM- en NL-gebieden ook worden gevisualiseerd in opeenvolgende asymmetrische segmenten (figuur 5A-C, gelabelde middenpanelen, wit, onderbroken omlijnd gebied). Vergrote beelden (60x objectief) tonen de tonotopische as van de auditieve kernen terwijl deze langs de rostrale-mediale naar caudo-laterale as loopt (figuur 5A-C, rechts, satellietinzet). De oriëntatie van segmenten in figuur 5 is vergelijkbaar met die in figuur 2. Ze contrasteren met de traditionele presentatie van beelden, maar zijn meer geschikt voor elektrofysiologische experimenten. Figuur 1: Representatieve coronale seriële secties van de hersenstam. (A-D) Links: plakjes van caudale tot rostrale as, de auditieve kernen en verbindingsvezels gemarkeerd met een witte stippelcirkel. De middelste insert is een grotere weergave van het auditieve gebied, waar kernen worden weergegeven binnen witte stippelcirkels a: NM en b: NL. Pijlen tonen afferente vezels van de gehoorzenuw en pijlpunt toont NM axon-bifurcatie in A,B. Pijl toont NA in C. Laterale witte stippelcirkel toont SON in C,D. Rechts: satellietinzet toont deze kernen op 60x objectief: a: NM en b: NL. Afkortingen: NM = nucleus magnocellularis; NL = nucleus laminaris; NA = nucleus angularis; SON = superieure olivaire kern; LF = relatief laagfrequente neuronen; MF = middelfrequente neuronen; HF = hoogfrequente neuronen; D = dorsaal; L = lateraal; V = ventraal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Representatieve sagittale seriële delen van de hersenstam. (A-C) Links: plakjes van laterale naar mediale as met de auditieve kernen gelabeld in een witte stippelcirkel. De middelste insert toont hetzelfde auditieve kerngebied in groter zicht, gemarkeerd binnen witte stippelcirkels. (A) Witte stippelcirkel in het midden van het segment markeert de SON; pijl met gehoorzenuwvezels en pijlpunt met NA. Een donkere zwarte vlek aan de rechterkant van het segment is een beeldartefact. Gebieden van het cerebellum kunnen dorsaal ten opzichte van het gehoorgebied worden gezien in zowel plakjes A als B in het linkerpaneel. (B) Een sagittale plak waarvan de oriëntatie werd gewijzigd in het coronale vlak (tijdens het snijden). Het auditieve gebied werd geïdentificeerd met blauwe kleurstof (zwarte pijl) en opnieuw gesneden in het sagittale vlak. (A-C) Middelste insert NM en NL gebied gemarkeerd onder stippelige witte lijnen. Rechts: satellietweergave toont a: NM en b: NL waargenomen in 60x objectieve vergroting. LF en HF tonotopische gradiënt in auditieve kernen wordt weergegeven langs de rostro-caudale as. Pijlen die wijzen naar het donkere gebied in (C) tonen zwaar gemyeliniseerde NM-vezels die over de middellijn door de mediale as lopen. De vezels verbinden aan weerszijden van auditieve kernen. Afkortingen: NM = nucleus magnocellularis; NL = nucleus laminaris; NA = nucleus angularis; SON = superieure olivaire kern; LF = relatief laagfrequente neuronen; HF = hoogfrequente neuronen; D = dorsaal; V = ventraal; R = rostral; C = caudaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Elektrofysiologische opnames van neuronale respons op somatische stroominjecties (−100 pA tot +200 pA, +10 pA stappen, 100 ms duur) in de huidige klemmodus. Neuronen werden geselecteerd voor opnames in dezelfde plak, maar op extreem tegenovergestelde regio’s van NM. (A,B) Representatieve neuronale responsen in een enkele coronale plak die relatieve isofrequentie-eigenschappen met subtiele verschillen aangeven. Responseigenschappen vertegenwoordigen twee verschillende MF-neuronen die zijn geregistreerd uit de meest mediale (A) en laterale (B) regio’s van NM in een coronale plak. (C,D) Representatieve neuronale opnames van een enkele sagittale plak. De opnames tonen een relatief LF NM-respons (C) en een HF NM-respons (D), wat de inhoudelijke verschillen in tonotopische gradiënt binnen een enkele sagittale sectie benadrukt. Afkortingen: NM = nucleus magnocellularis; LF = relatief laagfrequente neuronen; MF = middenfrequente neuronen; HF = hoogfrequente neuronen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Representatieve horizontale seriële delen van de hersenstam. (A,B) Links: plakjes langs de dorsale tot ventrale as, auditieve kernen zijn gemarkeerd met witte stippelcirkels. De8e hersenzenuw afferente vezels verbinden auditieve kernen gemarkeerd met pijl. De middelste insert is een groter beeld van het auditieve kerngebied met auditieve kernen gemarkeerd onder witte stippellijnen NM en NL-gebieden worden weergegeven. Een duidelijke topologische beweging van auditieve kernen is te zien in A,B. (A,B) Rechts: grote satellietweergave met a: NM en b: NL. Rechter insert toont auditieve kernen waargenomen in 60x objectieve vergroting en de gekromde topologische as van LF naar HF langs een caudo-laterale naar rostrale-mediale as. Afkortingen: NM = nucleus magnocellularis; NL = nucleus laminaris; LF = relatief laagfrequente neuronen; HF = hoogfrequente neuronen; L = lateraal; R = rostral; C = caudaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Representatieve horizontale/transversale acute hoekige (45°) seriële secties. (A-C) Links: seriële delen van de hersenstam, auditieve kernen gemarkeerd in witte stippelcirkel. De middelste insert is een grotere weergave van het auditieve gebied. (A) Middelste insert toont de grootste verspreiding van NM en NL neuronen in deze plakjes. (B,C) Middelste insert: auditieve kernen gemarkeerd in witte stippellijnen vertonen een geleidelijke topologische verandering in vergelijking met (A-C). Rechts: satellietinzet met auditieve kernen a: NM en b: NL in 60x objectiefvergroting. De tonotopische as van LF naar HF regio’s in NM en NL roteert hoekig van laterale naar mediale segmenten. Afkortingen: NM = nucleus magnocellularis; NL = nucleus laminaris; LF = relatief laagfrequente neuronen; HF = hoogfrequente neuronen; V = ventraal; R = rostral; D = dorsaal; C = caudaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullende video S1: Hyperpolariseren en depolariseren van somatische stroominjecties. Responseigenschappen van een laagfrequent en hoogfrequent neuron tot 100 ms somatische stroominjecties in de huidige klemmodus. Neuronen werden geselecteerd uit dezelfde sagittale hersenstam slice. Injecties variëren van -100 tot +200 pA in stappen van +10 pA stappen, 100 ms tijdsduur. Actiepotentialen worden gezien als reactie op voldoende depolariserende huidige stappen. De video komt overeen met de laatste sporen in figuur 3C. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende video S2: Hyperpolariseren en depolariseren van somatische stroominjecties. Net als bij Supplementary Video S1 toont deze video responseigenschappen van een laagfrequent en hoogfrequent neuron tot 100 ms somatische stroominjecties in de huidige klemmodus. Neuronen werden geselecteerd uit dezelfde sagittale hersenstam slice. Injecties variëren van -100 tot +200 pA in stappen van +10 pA stappen, 100 ms tijdsduur. Actiepotentialen worden gezien als reactie op voldoende depolariserende huidige stappen. De video komt overeen met de laatste sporen in figuur 3D. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Coronale secties van kippenembryonaal hersenstamweefsel hebben de studie van relatieve individuele iso-frequentie lamina gedurende tientallen jaren mogelijk gemaakt ^1,2,5. De tonotopische (d.w.z. frequentie) organisatie van de auditieve hersenstam van de kip is echter topologisch ingewikkeld en kan toegankelijker zijn in andere anatomische assen, afhankelijk van de specifieke onderzoeksvraag. Hoewel voldoende om anatomische en fysiologische vragen met betrekking tot individuele isofrequentiegebieden te onderzoeken, wordt de studie van tonotopische variaties en de ontwikkeling ervan in grotere auditieve hersenstamgebieden enigszins beperkt door coronale secties. Om deze beperking te overwinnen, beschrijft dit protocol benaderingen in de sagittale, horizontale en horizontale / transversale vlakken om aanvullende voorbeelden te geven van auditief hersenstamweefsel dat maximale tonotopische eigenschappen en gradiënten vertoont in een individuele hersenstamsectie.

Sagittale secties van auditieve hersenstamgebieden laten zien dat verschillende tonotopische gebieden verdeeld zijn over een groter gebied binnen de plak in vergelijking met coronale secties (sagittale auditieve gebied = ~ 300-600 μm, coronaal auditief gebied = ~ 200-350 μm). Nm- en NL-gebieden werden bijvoorbeeld gevisualiseerd over een groter gebied langs de rostro-caudale as in sagittale secties (bijv. Figuur 2B), en de functionele tonotopische gradiënt die langs deze anatomische as loopt, was grotendeels vervat in een enkele sagittale plak. Dit werd verder bevestigd met current-clamp opnames van intrinsieke neuronale verschillen die variëren langs de rostrale-caudale gradiënt zoals eerder gemeld ^14,15 (bijv. Figuur 3C,D). Toekomstige experimenten die anatomische en immunohistochemische eigenschappen langs de tonotopische as benadrukken, kunnen bekende gradiënten van auditieve eigenschappen binnen een enkel sagittale plakvlak verder onderzoeken. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, MAP2-kleurings- en kaliumkanaalexpressiepatronen, bekende gradiënten van dendritische architectuur en intrinsieke eigenschappen van NM en NL die eerder zijn aangetoond in opeenvolgende coronale secties¹⁶.

Horizontale delen van auditieve hersenstamgebieden laten zien dat de NM en NL zich in de middellijn bevinden. Een deel van de auditieve axonale vezels loopt diagonaal of loodrecht op het horizontale vlak (figuur 4). Deze vezels kunnen worden gevolgd door een acute hoekschijf 45° naar het sagittale vlak te maken. De resulterende horizontale / transversale plakjes waren groter dan de sagittale of horizontale plakjes, en lange axonale vezels liepen door de rostro-caudale as voor zowel ipsilaterale als contralaterale zijden. Zowel NM als NL kunnen worden gevisualiseerd in een groter diagonaal gebied (~400-700 μm) zodat contralaterale verbindingen langs een lateraal-mediale as kunnen worden gevisualiseerd. Daarnaast laat het horizontale/dwarse segmentvlak ook zien hoe de auditieve gebieden en de resulterende tonotopische gradiënt een hoekige draai maken (figuur 5). Hoekige blootstelling van contralaterale verbindingen in een groter gebied maakt deze plakjes geschikter voor elektrofysiologische stimulatie en microcircuitstudies dan traditionele coronale plakjes.

Bijkomende voordelen
De vorming van auditieve microcircuits vereist spatiotemporale coördinatie van signalen die neuronale overleving, synaptogenese, axonale differentiatie, dendritische architectuur en rijping bevorderen. Zo kan een alternatieve hersenstamsectie van het auditieve microcircuit van het kippenembryo worden gebruikt voor de volgende onderzoeksthema’s: morfologische organisatie van neuronen in topografisch verschillende dimensies; het organiseren en in kaart brengen van de connectomen van alle auditieve en vestibulaire kernen; identificatie en karakterisering van de activiteitspatronen van circuitbestanddelen in isofrequentie- en tonotopische vlakken; de topografische organisatie van exciterende versus remmende microcircuits en relaties met gespecialiseerde neuronpopulaties (kernen); ruimtelijke locatie van auditieve kernenneuronen en de voorspellende CF¹⁷; systematische targeting van specifieke tonotopische neuronale typen; het volgen van voorlopercellen en hun ontwikkeling tot geconserveerde kernen; genetische afstamming van cellen tot de evolutie van neuronale circuits¹⁸; vergelijkende hersenstamanatomie tussen soorten; onderzoek van vestibulaire circuits zoals Het vestibulaire complex (DC)¹⁹ van Deiter; en synchronie en kruisbespreking tussen vestibulaire kernen.

Een veelzijdige benadering met behulp van verschillende slice-vlakken kan helpen bij het beantwoorden van fundamentele vragen over onbekende anatomische en biofysische eigenschappen van hersenstammicrocircuits. Een goed voorbeeld is de relatie tussen grote auditieve kernen (NM, NA, NL en SON) en de vestibulaire kernen, waaronder de dorsale kern van de laterale lemniscus (LLDp), de semilunaire kern (SLu)²⁰ en de tangentiële kern (TN)³. Dit protocol en deze op slices gebaseerde studies hebben echter enkele beperkingen.

Voorzorgsmaatregelen en beperkingen
Afhankelijk van de instelling die de experimenten uitvoert, kunnen ethische richtlijnen en de omgang met kippenembryo’s verschillen. Hoewel de National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals snelle onthoofding mogelijk maken, zijn er alternatieve methoden voor euthanasie van^{kippenembryo’s 21}. Vroeg ontwikkelend hersenstamweefsel van kippenembryo’s is zacht en delicaat in vergelijking met oudere embryo’s. Het heeft verschillende verbindingen en bloedvaten op het oppervlak die extra voorzichtigheid vereisen bij het verwijderen ervan. Weefsel moet in ijskoude dACSF worden bewaard en worden doordrenkt met 95% O₂/5% CO₂ om de levensvatbaarheid te vergroten.

De sagittale snijmethode is alleen nuttig voor ipsilaterale tonotopie. Deze snijmethode biedt grotere plakjes dan coronale plakjes, waarvan de behandeling precair kan zijn. Men kan de plakjes echter bijsnijden met behulp van kruisnaaldmethoden die elders in detail worden beschreven²². Het gebruik van 4% LMP agarose blok ingebedde hersenstam kan delicate structuren in plakjes redden, maar zorg ervoor dat er geen te hete agarose wordt gegoten. Door het snel in te stellen door de agarose-geblokkeerde hersenstam gedurende ~ 1 minuut in een gekoelde omgeving te plaatsen, worden plakjes levensvatbaarder voor elektrofysiologische opnames.

Toepassing van secondelijm in overmatige hoeveelheden kan giftig zijn. Het moet minimaal worden toegepast en overtollige hoeveelheden moeten onmiddellijk worden gewassen door de dACSF te vervangen. Voor acute hoekige (45°) plakjes is het snijden van de hoek van het agaroseblok van cruciaal belang; men kan een spiegel gebruiken om de voorhoek te zien tijdens het snijden van het agarose blok met een scherp mes. In de handel verkrijgbare messen kunnen een waslaag hebben die met alcohol moet worden afgeveegd en voor gebruik moet worden gedroogd. Optimalisatie is vereist voor de snijsnelheid en frequentie van het vibratoom, omdat axonale vezeltufjes harder zijn dan corticale of matrixweefsel. Het houden van een hoge amplitude en het gebruik van gekoelde dissectie-oplossing kan weefselschade voorkomen.

Alle oplossingen moeten vers worden bereid en Ca²⁺ en Mg²⁺ moeten aan de ACSF worden toegevoegd na het borrelen van 95% O₂/5% CO₂ . Anders kan er neerslag zijn van Ca²⁺. Een penseel moet worden gebruikt om de plakjes voorzichtig in het vibratoom te hanteren. Houd de totale snijtijd indien mogelijk onder de 15 minuten. Een glazen Pasteur pipet kan worden gebruikt om hersenstamplakken te manoeuvreren.

Gebruik geen reinigingsmiddel of bijtende wasmiddelen voor glaswerk en apparatuur die in contact komen met de plakjes die in de elektrofysiologie worden gebruikt. De gemaakte beelden vertegenwoordigen het uiterlijk van 200-300 μM dik weefsel onder differentiële interferentiecontrast (DIC) optica. De visuele kwaliteit zal slechter zijn dan immunohistochemie of elektronenmicroscopie, maar het geeft nauwkeurig weer wat een experimentator zal zien bij het uitvoeren van elektrofysiologische opnames.

Studies met betrekking tot de vroege ontwikkeling van microcircuits langs een alternatieve anatomische as, of ze nu dorsaal-ventraal, rostral-caudaal of ipsilateraal-contralateraal zijn, zijn beperkt in de auditieve hersenstam van de kip. Een reden hiervoor is dat de rol van transcriptionele codes en regulatie van tonotopische ontwikkeling in de hersenstam nog steeds niet volledig wordt begrepen. Functionele fenomenen zoals top-down modulatie en spontane activiteit gaan vaak verloren bij het observeren van activiteit in vitro. In vivo onderzoek wordt echter aangevuld met specifieke en directe opnames van enkele neuronen die alleen mogelijk zijn in deze slice-omstandigheden. De verfijning van het verkrijgen van hersenstamweefsel langs verschillende oriëntaties zou inzichtelijke informatie kunnen opleveren over de ontwikkeling en complexiteit van tonotopische gradiënten in het auditieve hersenstammicrocircuit van de kip.

Materials

Adobe photoshop 2021	Adobe
Anti-vibration table 30"x 36" – OTMC – 63533	TMC
Cell sens standard software	OLYMPUS
Digidata 1440A	MOLECULAR DEVICES
Digital amplifier  multiclamp 700B	MOLECULAR DEVICES
DSK line-up linearslicer pro7	TED PELLA, INC
Micromanipulator MPC-385 / OSI-MPC-385-2	OLYMPUS AMERICA INC
Micropipette puller P-97	SUTTER INSTRUMENTS
Microscope BX51W1	OLYMPUS AMERICA INC
MS ICE software	Microsoft Corporation
Ohaus balance model AV212	Ohaus Adventurer
Olympus DPSI0 /DPS80 camera	OLYMPUS
pClamp and Axoclamp data Acquisition Softwares	MOLECULAR DEVICES
pH meter lab 850 benchtop	SCHOTT INSTRUMENTS
Sharp stainless blade	Dorco/Personna
Vapor pressure osmometer model 5600	WESCOR INC
Water purification systems Smart2pure 6UV/UF	Thermo Scientific
Chemicals- list
Agrose Low melt IB70051	IBI SCIENTIFIC
CaCl2 (Calcium Chloride)	ACROS organics
Cynergy instant adhesive CA6001	Resinlab
Dextrose (D-(+)-glucose)	VWR Life Science
Ethyl alcohol	IBI SCIENTIFIC
KCl (Potassium Chloride)	Amresco.Inc
MgCl2 (Magnesium Chloride)	Sigma-Aldrich
NaCl (Sodium Chloride)	Amresco.Inc
NaH2PO4 (Sodium Dihydrogen Phosphate)	Amresco.Inc
NaHCO3 (Sodium Bicarbonate)	Amresco.Inc