여기서 우리는 하나의 뇌간 조각 내에서 긴장성 특성과 발달 궤적을 조사하기 위해 닭 배아의 비관상 청각 뇌간 조각을 얻기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 슬라이스는 시상, 수평 및 수평/횡단면을 포함하며, 이는 전통적인 관상 섹션보다 개별 슬라이스 평면 내에서 더 큰 토노토픽 영역을 포함한다.
닭 배아는 청각 뇌간을 연구하기 위해 널리 받아 들여지는 동물 모델로, 고도로 전문화 된 미세 회로와 신경 토폴로지로 구성되어 있습니다. 토노 토픽 축은 주둥이-내측 평면에서 고주파 소리의 분리 된 인코딩과 꼬리 측면 영역에서 저주파 인코딩을 허용합니다. 전통적으로, 배아 조직의 관상 뇌간 조각은 상대적인 개별 등주파 층의 연구를 허용합니다. 개별 등주파수 영역과 관련된 해부학 적 및 생리 학적 질문을 조사하기에 충분하지만, 더 큰 청각 뇌간 영역에서의 긴장 성 변이와 발달에 대한 연구는 다소 제한적입니다. 이 프로토콜은 하부 청각 뇌간에서 주파수 영역의 더 큰 구배를 포함하는 닭 배아의 뇌간 절단 기술을 보고합니다. 닭 청각 뇌간 조직에 대한 다양한 슬라이스 방법을 사용하면 하나의 뇌간 슬라이스 내에서 전기 생리 학적 및 해부학 적 실험이 가능하며, 여기서 더 큰 농도의 구배와 발달 궤적이 관상 동맥 절편보다 더 잘 보존됩니다. 다중 슬라이싱 기술을 통해 청각 뇌간 미세 회로의 다양한 해부학적, 생물물리학적 및 긴장성 특성에 대한 향상된 조사를 수행할 수 있습니다.
닭 배아는 세포 생물학, 면역학, 병리학 및 발달 신경 생물학을 포함한 수많은 다양한 과학 분야에서 기본적인 생물학적 질문을 연구하는 귀중한 연구 모델입니다. 닭 청각 뇌간의 미세 회로는 청각 형태 및 생리학 측면에서 이해할 수있는 고도로 전문화 된 회로의 훌륭한 예입니다. 예를 들어, Rubel and Parks (1975)는 닭 핵 목장 세포 (NM)와 핵 층류 (NL)의 안압 방향 (즉, 주파수 구배)을 시상면에 대해 ~ 30 ° 배향 된 핵의 축을 가로 지르는 선형 함수로 처음 설명했습니다. NM과 NL의 개별 뉴런은 주둥이-내측 평면을 따라 꼬리 측면 영역으로 특성 주파수(CF)로 알려진 최상의 소리 주파수를 인코딩합니다. 고주파에 민감한 뉴런은 주둥이-내측 영역에 있고 저주파에 민감한 뉴런은 꼬리-측면으로 위치합니다. 따라서 청각 특성을 연구하기 위한 청각 뇌간 조직의 전통적인 해부 방법은 연속적인 관상 절편을 활용했습니다. 실제로, 닭 배아의 청각 미세 회로는 수십 년 동안 연속적인 꼬리에서 코로나 평면 뇌간 조각을 통해 긴장성 청각 기능의 신호 처리를 연구하기위한 모델 시스템으로 확립되었습니다 1,2,3,4,5,6.
그러나 NM과 NL의 긴장 조직은 위상 학적으로나 형태 학적으로 복잡합니다. 청각 신경 입력은 높은 CF 입력이 수지상 NM 세포의 체세포 둘레의 최소 1/4을 덮는 끝 전구와 같은 구조에서 종료되도록 분포됩니다. 반대로, 낮은 CF 입력은 엔드 전구와 같은 단자로 구성되지 않고 NM 뉴런의 수상 돌기에 여러 개의 부톤 시냅스로 구성됩니다. 중간 CF 입력은 끝 전구 및 부톤과 같은 시냅스 4,7,8,9,10,11,12로 종료됩니다. NL에서 고도로 고정 관념의 수지상 구배는 수지상 길이뿐만 아니라 수지상 폭에서도 분명합니다. 이 독특한 수지상 구배는 토노 토픽 축과 밀접하게 일치합니다. 수상 돌기는 길이가 11 배 증가하고 너비가 높은 CF에서 낮은 CF 뉴런으로 각각 5 배 증가합니다6. 관상 조각에서 이러한 핵의 복잡한 분포를 극복하기 위해 이 프로토콜은 시상면, 수평 및 수평/횡단면에서 해부 접근 방식을 설명합니다. 이러한 슬라이싱 기술은 개별 슬라이스 평면에서 최대 토픽 특성을 나타내는 청각 뇌간 조직의 예를 제공합니다.
닭 배아 뇌간 조직의 관상 동맥 절편은 수십 년 동안 상대적인 개별 등주파 층에 대한 연구를 허용했습니다 1,2,5. 그러나 닭 청각 뇌간의 안압 (즉, 빈도) 조직은 위상 학적으로 복잡하며 특정 연구 질문에 따라 다른 해부학 적 축에서 더 쉽게 접근 할 수 있습니다. 개별 등주파 영역과 관련된 해부학 적 및 생리 학적 질문을 조사하기에 충분하지만, 더 큰 청각 뇌간 영역에서의 긴장 성 변이와 발달에 대한 연구는 관상 절편에 의해 다소 제한됩니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 이 프로토콜은 시상면, 수평 및 수평/횡단면의 접근 방식을 설명하여 개별 뇌간 섹션에서 최대 긴장성 특성과 기울기를 나타내는 청각 뇌간 조직의 추가 예를 제공합니다.
청각 뇌간 영역의 시상 절편은 관상 절편에 비해 슬라이스 내의 더 큰 영역에 걸쳐 서로 다른 안압 부위가 분포되어 있음을 보여줍니다 (시상 청각 영역 = ~ 300-600 μm, 관상 청각 영역 = ~ 200-350 μm). 예를 들어, NM 및 NL 영역은 시상 섹션 (예 : 그림 2B)에서 로스트로-꼬리 축을 따라 더 큰 영역에 걸쳐 시각화되었으며,이 해부학 적 축을 따라 실행되는 기능적 안압 구배는 주로 단일 시상 슬라이스 내에 포함되었습니다. 이것은 이전에 보고된바와 같이 주둥이-꼬리 구배를 따라 변하는 고유 뉴런 차이의 전류 클램프 기록으로 추가로 확인되었습니다(예: 그림 3C,D). 토노 토픽 축을 따라 해부학 적 및 면역 조직 화학적 특성을 강조하는 향후 실험은 단일 시상 슬라이스 평면 내에서 청각 특성의 알려진 구배를 추가로 조사 할 수 있습니다. 여기에는 MAP2 염색 및 칼륨 채널 발현 패턴이 포함되지만 이에 국한되지는 않으며, 이는 이전에 연속적인 관상 동맥 섹션16에서 보여진 수지상 아키텍처 및 NM 및 NL의 고유 특성의 알려진 구배입니다.
청각 뇌간 영역의 수평 섹션은 NM과 NL이 정중선을 향해 위치한다는 것을 보여줍니다. 청각 축삭 섬유의 일부는 수평면에 대각선 또는 수직으로 움직입니다 (그림 4). 이 섬유는 시상면에 대해 45 °의 예리한 각진 슬라이스를 만들어 따라갈 수 있습니다. 그 결과 수평 / 횡단 슬라이스는 시상 또는 수평 슬라이스보다 컸으며, 긴 축삭 섬유는 동측 및 반대측 모두에 대해 로스트로 꼬리 축을 통과했습니다. NM과 NL은 모두 더 큰 대각선 영역(~400-700μm)에서 시각화할 수 있으므로 반대쪽 연결을 측면-내측 축을 따라 시각화할 수 있습니다. 또한 수평/가로 슬라이스 평면은 청각 영역과 결과 안압 그라데이션이 각도 회전을 만드는 방법도 보여줍니다(그림 5). 더 넓은 영역에서 반대쪽 연결의 각도 노출은 이러한 슬라이스를 기존의 코로나 슬라이스보다 전기 생리 학적 자극 및 미세 회로 연구에 더 적합하게 만듭니다.
추가 이점
청각 미세 회로의 형성은 신경 세포 생존, 시냅스 형성, 축삭 분화, 수지상 구조 및 성숙을 촉진하는 단서의 시공간 조정을 필요로합니다. 따라서, 닭 배아 청각 미세 회로의 대안적인 뇌간 섹션은 다음과 같은 연구 주제에 사용될 수있다 : 지형적으로 다른 차원에서 뉴런의 형태 학적 조직; 모든 청각 및 전정 핵의 커넥톰을 조직하고 매핑하는 것; iso-frequency 및 tonotopic 평면에서 회로 구성 요소의 활동 패턴의 식별 및 특성화; 흥분성 대 억제 성 미세 회로의 지형 조직 및 특수 뉴런 집단 (핵)과의 관계; 청각 핵 뉴런의 공간적 위치 및 그의 예측 CF17; 특정 토노 토픽 신경 유형의 체계적인 표적화; 전구 세포 및 보존 된 핵으로의 발달 추적; 신경 회로의 진화에 대한 세포의 유전 적 계통18; 종 간 비교 뇌간 해부학; Deiter의 전정 복합체 (DC)와 같은 전정 회로 조사19; 그리고 전정 핵 사이의 동시성과 교차 대화.
다른 슬라이스 평면을 사용하는 다각적 인 접근 방식은 뇌간 미세 회로의 알려지지 않은 해부학 적 및 생물 물리학 적 특성에 대한 근본적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 좋은 예는 주요 청각 핵 (NM, NA, NL 및 SON)과 외측 렘니스 커스의 등쪽 핵 (LLDp), 반월 핵 (SLu) 20 및 접선 핵 (TN)3을 포함한 전정 핵 사이의 관계입니다. 그러나 이 프로토콜과 이러한 슬라이스 기반 연구에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다.
주의 사항 및 제한 사항
실험을 수행하는 기관에 따라 윤리적 지침과 닭 배아의 취급이 다를 수 있습니다. 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 지침은 신속한 참수를 허용하지만 닭 배아 안락사에 대한 대체 방법이 있습니다21. 초기에 발달하는 닭 배아 뇌간 조직은 오래된 배아에 비해 부드럽고 섬세합니다. 표면에 여러 개의 연결부와 혈관이있어 제거 할 때 특별한주의가 필요합니다. 조직은 얼음처럼 차가운 dACSF에 보관하고 생존력을 높이기 위해 95 % O 2 / 5 % CO2로 관류해야합니다.
시상 슬라이싱 방법은 동측 안압에만 유용합니다. 이 슬라이싱 방법은 코로나 슬라이스보다 더 큰 슬라이스를 제공하며, 그 처리는 불안정할 수 있습니다. 그러나, 다른 곳에서 상세히 설명된 교차 바늘 방법을 사용하여 슬라이스를 트리밍할 수 있다(22). 4 % LMP 아가 로스 블록 내장 뇌간을 사용하면 섬세한 구조를 조각으로 저장할 수 있지만 지나치게 뜨거운 아가 로스를 붓지 않도록주의해야합니다. 아가로오스 차단 뇌간을 냉장된 환경에 ~1분 동안 배치하여 빠르게 설정하면 슬라이스가 전기생리학적 기록에 더 실용적입니다.
과량의 슈퍼 접착제를 사용하면 독성이있을 수 있습니다. 최소한으로 적용해야하며 잉여량은 dACSF를 교체하여 즉시 세척해야합니다. 예각 (45 °) 슬라이스의 경우 아가 로스 블록의 각도를 절단하는 것이 중요합니다. 거울을 사용하여 날카로운 칼날로 아가 로스 블록을 자르면서 정면을 볼 수 있습니다. 시중에서 판매되는 블레이드에는 알코올로 닦아내고 사용하기 전에 건조해야 하는 왁스 코팅이 있을 수 있습니다. 축삭 섬유 술은 피질 또는 매트릭스 조직보다 단단하기 때문에 비브라톰 절단 속도와 빈도에 대한 최적화가 필요합니다. 높은 진폭을 유지하고 냉장 해부 용액을 사용하면 조직 손상을 예방할 수 있습니다.
모든 용액은 신선하게 준비되어야하며,Ca 2+ 및 Mg 2+ 는 95 % O 2 / 5 % CO2 를 버블 링 한 후 ACSF에 첨가되어야한다. 그렇지 않으면Ca2+의 침전이있을 수 있습니다. 비브라톰 내에서 슬라이스를 부드럽게 다루려면 붓을 사용해야 합니다. 가능하면 총 슬라이싱 시간을 15분 미만으로 유지하십시오. 유리 파스퇴르 피펫은 뇌간 조각을 조작하는 데 사용할 수 있습니다.
전기 생리학에 사용되는 조각과 접촉하는 유리 제품 및 장비에 세제 또는 부식성 세척제를 사용하지 마십시오. 촬영된 이미지는 미분 간섭 대비(DIC) 광학에서 200-300μM 두께의 조직 모양을 나타냅니다. 시각적 품질은 면역 조직 화학 또는 전자 현미경보다 좋지 않지만 전기 생리 학적 기록을 수행 할 때 실험자가 보게 될 것을 정확하게 반영합니다.
등-복부, 주둥이-꼬리 또는 동측-반대측이든 대체 해부학적 축을 따라 미세 회로의 초기 발달과 관련된 연구는 닭 청각 뇌간에서 제한됩니다. 그 이유 중 하나는 뇌간에서 전사 코드의 역할과 긴장성 발달 조절이 아직 완전히 이해되지 않았기 때문입니다. 하향식 변조 및 자발적인 활동과 같은 기능적 현상은 시험관 내에서 활동을 관찰 할 때 종종 손실됩니다. 그러나 생체 내 연구는 이러한 슬라이스 조건에서만 가능한 특이적이고 직접적인 단일 뉴런 기록으로 보완됩니다. 다른 방향을 따라 뇌간 조직을 얻는 개선은 닭 청각 뇌간 미세 회로에서 긴장성 구배의 발달과 복잡성에 대한 통찰력있는 정보를 제공 할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 NIH/NIDCD R01 DC017167 보조금의 지원을 받습니다. 이전 버전의 원고에 대한 편집 의견을 제공한 Kristine McLellan에게 감사드립니다.
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