תרביות ראשוניות של אסטרוציטים ומיקרוגליה של חולדות והשימוש בהן בחקר טרשת אמיוטרופית צידית

Summary

אנו מציגים כאן פרוטוקול כיצד להכין תרביות ראשוניות של תאי גליה, אסטרוציטים ומיקרוגליה מקליפת המוח של חולדות להדמיית וידאו בהילוך מהיר של Ca²⁺ תוך-תאי למחקר על פתופיזיולוגיה של טרשת אמיוטרופית צידית במודל החולדות hSOD1^G93A .

Abstract

פרוטוקול זה מדגים כיצד להכין תרביות ראשוניות של תאי גליה, אסטרוציטים ומיקרוגליה מקליפת המוח של חולדות ספראג דאולי וכיצד להשתמש בתאים אלה לצורך חקר הפתופיזיולוגיה של טרשת אמיוטרופית צידית (ALS) במודל hSOD1^G93A של חולדה. ראשית, הפרוטוקול מראה כיצד לבודד ולתרבת אסטרוציטים ומיקרוגליה מקליפת המוח של חולדות לאחר הלידה, ולאחר מכן כיצד לאפיין ולבדוק את הטוהר של תרביות אלה על ידי אימונוציטוכימיה באמצעות סמן החלבון החומצי הגלי (GFAP) של אסטרוציטים וסמן המתאם הקושר סידן מיונן 1 (Iba1). בשלב הבא מתוארות שיטות להעמסת צבע (Fluo 4-AM הרגיש לסידן) של תאים בתרבית והקלטות של שינויים ב-Ca²⁺ בניסויי הדמיית וידאו על תאים חיים.

הדוגמאות להקלטות וידאו כוללות: (1) מקרים של Ca²⁺ הדמיה של אסטרוציטים בתרבית שנחשפו באופן חריף לאימונוגלובולין G (IgG) שבודדו מחולי ALS, והראו תגובה אופיינית וספציפית בהשוואה לתגובה ל-ATP כפי שהודגם באותו ניסוי. דוגמאות מראות גם עלייה חולפת בולטת יותר בריכוז הסידן התוך-תאי שמעורר ALS IgG באסטרוציטים hSOD1^G93A בהשוואה לבקרים שאינם מהונדסים; (2) Ca 2+ הדמיה של אסטרוציטים בתרבית במהלך דלדול מאגרי הסידן על ידי thapsigargin (Thg), מעכב לא תחרותי של הרשתית האנדופלסמית Ca 2+ ATPase, ולאחר מכן ערך סידן המופעל על ידי אחסון הנגרם על ידי הוספת סידן בתמיסת ההקלטה, המדגימה את ההבדל בין פעולת Ca ²⁺ בחנות hSOD1^G93A ובאסטרוציטים שאינם מהונדסים; (3) Ca 2⁺ הדמיה של המיקרוגליה התרבית מראה בעיקר חוסר תגובה ל-ALS IgG, בעוד שיישום ATP גרם לשינוי Ca²⁺. מאמר זה גם מדגיש אזהרות ואזהרות אפשריות לגבי צפיפות תאים קריטית וטוהר התרביות, תוך בחירת הריכוז הנכון של טכניקות צבע Ca²⁺ והעמסת צבע.

Introduction

טכניקות של תרביות תאים הולידו התקדמות רבה בתחומים מגוונים של נוירופיזיולוגיה תאית בבריאות ובמחלות. במיוחד, תרביות תאים ראשוניות, שבודדו זה עתה מרקמה עצבית של חיית מעבדה, מאפשרות לנסיין לחקור מקרוב את התנהגותם של תאים מגוונים במדיות ביוכימיות שונות ובמערכים פיזיולוגיים שונים. שימוש באינדיקטורים פיזיולוגיים פלואורסצנטיים שונים כגון הצבעים הרגישים ל-Ca²⁺ בשילוב עם מיקרוסקופיית וידאו בהילוך מהיר מספק תובנה טובה יותר לגבי התהליכים הביופיזיים והביוכימיים של התאים בזמן אמת.

ALS היא מחלה נוירודגנרטיבית הרסנית המשפיעה על נוירונים מוטוריים עליונים ותחתונים¹. למחלה יש פתוגנזה מורכבת מהסוג המשפחתי אך בעיקר של הצורה הספורדית (90% מהמקרים)². ידוע שמנגנונים אוטונומיים שאינם תאיים תורמים לפתופיזיולוגיה של ALS, בעיקר בשל התפקיד החיוני של תאי גליה³. ALS מאופיינת היטב גם כמחלה נוירו-דלקתית עם מעורבות של גורמים הומורליים ותאיים של דלקת.

אימונוגלובולין G נמצא בשימוש נרחב כסמן מולקולרי ב- ALS ובמחלות נוירודגנרטיביות אחרות. לימוד רמת הסרום של סמן זה יכול להצביע על נוכחות ושלב של דלקת עצבית במחלה ^4,5,6, בעוד נוכחותו בנוזל המוח והשדרה יכולה להצביע על הפרה של מחסום הדם במוח⁷. IgGs זוהו גם כמשקעים בתאי העצב המוטוריים של חוט השדרה של חולי ALS⁷. עם זאת, גישה זו הראתה כמה חוסר עקביות במתאם של רמת IgGs עם השלב והמאפיינים של המחלה⁶.

IgG שבודד מהסרה של חולי ALS (ALS IgG) יכול לגרום לתגובת סידן באסטרוציטים נאיביים⁸ ושחרור גלוטמט בתאי עצב, מה שמצביע על אפקט אקסיטוטוקסי – סימן היכר של פתולוגיה של ALS⁹. עם זאת, מחקרים על מודל החולדות hSOD1^G93A ALS (המכיל עותקים מרובים של מוטציית SOD1 האנושית 10) הראו מספר סמנים של עקה חמצונית בתאי נוירוגליה בתרבית 11, רקמות 12,13,14^, או חיות^{חיות 13}. ראוי לציין כי האסטרוציטים שגודלו בתרבית ממודל חולדות ה-ALS היו מועדים יותר לעקה חמצונית הנגרמת על-ידי חמצן מאשר האסטרוגליה של חברי המלטה שאינם מהונדסים¹¹.

תאים מיקרוגליאליים בתרבית מושפעים מ-ALS IgG בצורה פחות נראית לעין. כלומר, קו תאים מיקרוגליאליים מסוג BV-2 הציג עלייה באות מסמנים פלואורסצנטיים של עקה חמצונית בתגובה ליישום של דגימות 4/11 בלבד של חולי ALS IgG¹⁵. ידוע כי מיקרוגליה משתתפת בפאתולוגיות נוירו-דלקתיות רבות, מה שמוסיף לעקה חמצונית ולשלב התקדמות מאוחר במנגנון האוטונומי הלא-תאי של ALS^16,17. עם זאת, הנתונים עם ALS IgGs הצביעו על כך שתאים אלה עשויים להיות לא תגובתיים כמו אסטרוציטים לגורמים הומורליים אלה של דלקת ALS. מספר מחקרים נערכו עם אסטרוציטים ראשוניים ממודלים של ALS murine, לא רק בגורים אלא גם בבעלי חיים סימפטומטיים, על המוח או על חוט השדרה 18,19,20,21. זה נכון גם לגבי תרביות ראשוניות מיקרוגליות, אם כי במידה פחותה מאשר אסטרוציטים ובעיקר מאזורי מוח בשלב העוברי^22,23,24.

אנו משתמשים בהדמיית וידאו בהילוך מהיר של Ca²⁺ על תאים בתרבית בעיקר כאמצעי לעקוב אחר מעברים תוך-תאיים של יון זה כסמן פיזיולוגי של אקסיטוטוקסיות. לפיכך, על ידי אפיון ביופיזי של ארעיות אלה (משרעת, שטח תחת חולף, זמן עלייה, תדירות) החוקר יכול לקבל פרמטרים אבחוניים ניסיוניים ממודלים תאיים מגוונים של ניוון עצבי. טכניקה זו מציעה אפוא יתרון של הערכה פיזיולוגית כמותית של IgGs כסמנים ביולוגיים של מחלות. יש גוף גדול של ספרות על התפקיד של IgGs ו Ca^{2 +} באינדוקציה של ALS. רוב המחקרים הללו בוצעו על ידי גרימת ALS על ידי הזרקת IgGs של מטופלים לחיות ניסוי 25,26,27,28,29^, אשר לאחר מכן הראו עלייה תוך תאית Ca ²⁺ ותצהירי IgG. שורה של מחקרים בחנו את ההשפעה של ALS IgGs על הסינפסה המוטורית במבחנה^30,31,32. בהקשר הנ”ל, הטכניקה המוצגת כאן שמה את הדגש על תאי הגליה כשחקנים חשובים במנגנון האוטונומי הלא-תאי של ALS ומכמתת את התגובה האקסיטוטוקסית הפוטנציאלית שלהם ל- IgGs כגורמים הומוריסטיים של דלקת עצבית. לגישה זו עשוי להיות יישום רחב יותר בבדיקת גורמים הומוריסטיים אחרים כגון סרה שלמה, CSF או ציטוקינים במערכות תרביות תאים שונות ובמודלים תאיים של דלקת כללית.

מאמר זה מתאר כיצד להכין תרביות ראשוניות של תאי גליה, אסטרוציטים ומיקרוגליה מקליפת המוח של חולדות ספראג דאולי, וכיצד להמשיך להשתמש בתאים אלה כדי לחקור פתופיזיולוגיה של ALS עם IgG שמקורו בסרה. פרוטוקולים מפורטים עבור טעינת צבע של תאים בתרבית (איור 1) והקלטות של שינויים של Ca²⁺ בניסויי דימות וידאו בהילוך מהיר. דוגמאות להקלטות וידאו יראו כיצד תאי גליה מגיבים ל-ALS IgG בהשוואה ל-ATP, כשהאחרון מפעיל קולטני ממברנה פורינרגיים. מוצגת לראשונה דוגמה לאופן שבו אסטרוציטים שבודדו ממוח החולדה hSOD1^G93A ALS מגיבים עם תגובת Ca 2+ בולטת יותר ל-ALS IgG בהשוואה לבקרות שאינן מהונדסות, וכיצד לקשר את התהליך הזה להבדלים בפעולת המאגר של Ca²⁺. כמו כן מוצגת דוגמה להדמיית סידן בתאים מיקרוגליאליים המאותגרים באופן חריף עם ALS IgG, עם תגובה צנועה בלבד של סידן תוך תאי.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות האיחוד האירופי להגנה על בעלי חיים למטרות מדעיות ובאישור הוועדה האתית של הפקולטה לביולוגיה, אוניברסיטת בלגרד (אישור מספר EK-BF-2016/08). לגבי חומר המטופל (sera עבור IgGs), הוא נאסף לבדיקה קלינית שגרתית בהסכמת המטופל מדעת בהתאם לקוד האתי של ההסתדרות הרפואית העולמית (הצה…

Representative Results

אפיון סוגי תאי גליה שונים בתרביתבדרך כלל לוקח 15-21 ימים לייצר אסטרוציטים לניסויים, בעוד שלתאים מיקרוגליאליים לוקח 10-15 ימים לגדול. החיסון בוצע כדי להעריך את טוהר התאים של התרבית. איור 1 מראה את הביטוי של תיוג כפול של הסמן האסטרוציטי GFAP והסמן המיקרוגליאלי Iba1 בתרבוי?…

Discussion

מאמר זה מציג את השיטה של גידול תאים ראשוניים ככלי מהיר ו”על התקציב” לחקר היבטים שונים של פיזיולוגיה של התא (פתו) כגון ALS במודל hSOD1^G93A של חולדה. לפיכך, הטכניקה מתאימה למחקרים ברמת התא הבודד שניתן לבצע אקסטרפולציה ולחקור אותם ברמת ארגון גבוהה יותר (כלומר, בפרוסות רקמה או בחיה חיה). עם זאת, ל?…

Materials

15 mL tube	Sarstedt, Germany	62 554 502
2 mL tube	Sarstedt, Germany	72.691
21 G needle	Nipro, Japan	HN-2138-ET
23 G needle	Nipro, Japan	HN-2338-ET
5 mL syringe	Nipro, Japan	SY3-5SC-EC
6 mm circular glass coverslip	Menzel Glasser, Germany	630-2113
60 mm Petri dish	ThermoFisher Sientific, USA	130181
ATP	Sigma-Aldrich, Germany	A9062
AxioObserver A1	Carl Zeiss, Germany
Bovine serum albumine	Sigma-Aldrich, Germany	B6917
Calcium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	2110
Centrifuge	Eppendorf, Germany
DAPI	Sigma-Aldrich, Germany	10236276001
D-glucose	Sigma-Aldrich, Germany	158968
DMEM	Sigma-Aldrich, Germany	D5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody	Invitrogen, USA	A-21447
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody	Invitrogen, USA	A-21202
EDTA	Sigma-Aldrich, Germany	EDS-100G
EGTA	Sigma-Aldrich, Germany	E4378
”evolve”-EM 512 Digital Camera System	Photometrics, USA
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10500064
Fiji ImageJ Software	Open source under the GNU General Public Licence
FITC filter set	Chroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AM	Molecular Probes, USA	F14201
Goat anti-Iba1	Fujifilm Wako Chemicals, USA	011-27991
HEPES	Biowest, France	P5455
HighSpeed Solution Exchange System	ALA Scientific Instruments, USA
Incubator	Memmert GmbH + Co. KG, Germany
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	M2393
Matlab software	Math Works, USA
Mouse anti-GFAP	Merck Millipore, USA	MAB360
Mowiol 40-88	Sigma-Aldrich, Germany	324590
Normal donkey serum	Sigma-Aldrich, Germany	D9663
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, Germany	158127
Penicilin and Streptomycin	ThermoFisher Sientific, USA	15140122
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich, Germany	P5899
Potassium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	P5405
Potassium dihydrogen phosphate	Carlo Erba Reagents, Spain	471686
Shaker DELFIA PlateShake	PerkinElmer Life Sciencies, USA
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, Germany	S3817
Sodium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	S5886
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Carl ROTH GmbH	X987.2
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich, Germany	P5280
Thapsigargine	Tocris Bioscience, UK	1138
Triton X – 100	Sigma-Aldrich, Germany	T8787
Trypsin	Sigma-Aldrich, Germany	T4799
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520	Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor Imaging System	Visitron System Gmbh, Germany
VisiChrome Polychromator System	Visitron System Gmbh, Germany
VisiView high performance setup	Visitron System Gmbh, Germany
Xenon Short Arc lamp	Ushio, Japan