מחקר זה משתמש cytometry זרימה ושתי אסטרטגיות gating שונות על עכברים מבודדים perfused מוח choroid plexuses; פרוטוקול זה מזהה את תתי-הערכות העיקריות של תאי החיסון המאכלסות מבנה מוח זה.
המוח כבר לא נחשב לאיבר המתפקד בבידוד; צבירת ראיות מצביעה על כך ששינויים במערכת החיסון ההיקפית יכולים לעצב בעקיפין את תפקוד המוח. בממשק שבין המוח למחזור הדם המערכתי, מקלעות הכורואידים (CP), המהווים את מחסום הנוזל השדרתי בדם, הודגשו כאתר מפתח של תקשורת פריפריה-למוח. CP מייצר את הנוזל השדרתי, גורמים נוירוטרופיים ומולקולות איתות שיכולות לעצב הומאוסטזיס במוח. CP הם גם נישה חיסונית פעילה. בניגוד לפרנצ’ימה במוח, המאוכלסת בעיקר על ידי מיקרוגליה בתנאים פיזיולוגיים, ההטרוגניות של תאי החיסון של CP משחזרת את המגוון שנמצא באיברים היקפיים אחרים. המגוון והפעילות של תאי החיסון של CP משתנים עם ההזדקנות, הלחץ והמחלות ומווסתים את פעילות האפיתל של CP, ובכך מעצבים בעקיפין את תפקוד המוח. מטרת פרוטוקול זה היא לבודד את CP מורין ולזהות כ -90% מתת-קבוצות החיסון העיקריות המאכלסות אותם. שיטה זו היא כלי לאפיון תאי מערכת החיסון של CP ולהבנת תפקידם בניהול תקשורת בין הפריפריה למוח. הפרוטוקול המוצע עשוי לסייע בפענוח האופן שבו תאי מערכת החיסון של CP מווסתים בעקיפין את תפקוד המוח בבריאות ובמצבי מחלה שונים.
מאז גילוי מחסום הדם – מוח על ידי פול ארליך בסוף המאה ה –19, המוח נחשב כמעט מופרד מהאיברים האחרים ומחזור הדם. עם זאת, בעשור האחרון חלה הופעתה של התפיסה שתפקוד המוח מעוצב על ידי גורמים ביולוגיים שונים, כגון מיקרוביוטה במעיים ותאי חיסון מערכתיים ואותות1,2,3,4. במקביל, גבולות מוח אחרים כגון קרום המוח וזכוכית קרום המוח (CP) זוהו כממשקים של דיבורים צולבים חיסוניים-מוחיים פעילים ולא כרקמות מחסום אינרטיות5,6,7,8.
ה-CP מהווים את מחסום הנוזל השדרתי בדם, אחד הגבולות המפרידים בין המוח לפריפריה. הם ממוקמים בכל אחד מארבעת החדרים של המוח, כלומר, השלישי, הרביעי, ושניהם חדרים לרוחב, והם סמוכים לאזורים המעורבים neurogenesis כגון האזור subventricular ואזור תת-עורי של ההיפוקמפוס3. מבחינה מבנית, CP מורכבים מרשת של נימי דם fenestrated מוקף על ידי monolayer של תאי אפיתל, אשר מחוברים על ידי צמתים הדוקים ודבקים9,10. תפקידים פיזיולוגיים עיקריים של אפיתל CP כרוכים בייצור של נוזל השדרתי, אשר שוטף את המוח מטבוליטים פסולת ואגרגטים חלבון, ואת הייצור ואת המעבר מבוקר דם למוח של מולקולות איתות שונות כולל הורמונים וגורמים נוירוטרופיים11,12,13. מולקולות מופרשות מפעילות המוח בצורת CP, כלומר, על ידי ויסות נוירוגנזה ותפקוד מיקרוגליאלי14,15,16,17,17,18,19, מה שהופך את CP קריטי עבור הומאוסטזיס במוח. CP עוסקת גם בפעילויות חיסוניות שונות; בעוד שסוג התא החיסוני העיקרי בפרנצ’ימה במוח בתנאים לא פתולוגיים הוא מיקרוגליה, המגוון של אוכלוסיות תאי החיסון של CP רחב כמו באיברים היקפיים3,7, מה שמצביע על כך שערוצים שונים של ויסות ואיתות חיסוני פועלים ב- CP.
הרווח בין תאי האנדותל והאפיתל, CP stroma, מאוכלס בעיקר על ידי מקרופאגים הקשורים לגבול (BAM), המבטאים ציטוקינים פרו דלקתיים ומולקולות הקשורות להצגת אנטיגן בתגובה לאותות דלקתיים3. תת-סוג נוסף של מקרופאגים, תאי האפילקסוס של קולמר, נמצאים על פני השטח האפיליים של אפיתל CP20. CP stroma הוא גם נישה עבור תאים דנדריטיים, תאי B, תאי פיטום, בזופילים, נויטרופילים, תאי לימפה מולדים, ותאי T שהם בעיקר תאי זיכרון T מפעילים המסוגלים לזהות אנטיגנים של מערכת העצבים המרכזית7,21,22,22,23,24. בנוסף, ההרכב והפעילות של אוכלוסיות תאי מערכת החיסון ב- CP משתנים על הפרעה מערכתית או מוחית, למשל, במהלך הזדקנות 10,14,15,15,21,25, הפרעה מיקרוביוטה7, מתח26, ומחלה27,28. ראוי לציין, שינויים אלה הוצעו בעקיפין לעצב את תפקוד המוח, כלומר, שינוי של תאי CP CD4 + T לכיוון דלקת Th2 מתרחשת בהזדקנות המוח ומפעיל איתות חיסוני מן CP שעשוי לעצב ירידה קוגניטיבית הקשורה להזדקנות14,15,21,25,25,29 . הארת המאפיינים של תאי החיסון של CP תהיה אפוא חיונית כדי להבין טוב יותר את תפקודם הרגולטורי על פיזיולוגיה והפרשת אפיתל CP ובכך לפענח את השפעתם העקיפה על תפקוד המוח בתנאים בריאים ומחלות.
CP הם מבנים קטנים המכילים רק כמה תאים חיסוניים. הבידוד שלהם דורש microdissection לאחר שלב ראשוני של זלוף; תאי מערכת החיסון במחזור הדם היו מהווים מזהמים עיקריים. פרוטוקול זה נועד לאפיין את תת-קבוצות תאי המיאלואיד וה- T של CP באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מזהה כ -90% מאוכלוסיות תאי החיסון המרכיבים CP עכבר בתנאים לא דלקתיים, בהתאם לעבודות שפורסמו לאחרונה באמצעות שיטות אחרות לנתח הטרוגניות CP חיסונית7,10,28. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לאפיין שינויים בתא התא החיסוני של CP עם מחלות ופרדיגמות ניסיוניות אחרות ב vivo.
מחקרים שמטרתם להבין את התרומות החיסוניות להומיאוסטזיס המוח ולמחלות התמקדו בעיקר בתאים המתגוררים בתוך הפרנצ’ימה במוח, והזניחו גבולות המוח כגון CP, שהם בכל זאת תורמים חיוניים לתפקוד המוח2,3. הניתוח של אוכלוסיות תאי החיסון ב- CP הוא מאתגר בשל גודל קטן של CP, מספרים…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים למכון פסטר Animalerie Centrale ולחברי מתקן CB-UTechS על עזרתם. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מכון פסטר.
anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
EDTA | Ion chelator | ||
fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |