Protokollet presenterar de övergripande procedurerna i labbet som krävs vid genetisk testning före implantation för aneuploidi på en halvledarbaserad nästa generations sekvenseringsplattform. Här presenterar vi de detaljerade stegen för helgenomförstärkning, DNA-fragmentval, bibliotekskonstruktion, mallberedning och sekvensering av arbetsflöde med representativa resultat.
Nästa generations sekvensering har fått allt större betydelse i den kliniska tillämpningen vid bestämning av genetiska varianter. I det preimplantatoriska genetiska testet har denna teknik sina unika fördelar i skalbarhet, genomströmning och kostnad. För det preimplantationsgenetiska testet för aneuploidianalys ger det halvledarbaserade nästa generations sekvenseringssystemet (NGS) som presenteras här ett omfattande tillvägagångssätt för att bestämma strukturella genetiska varianter med en minsta upplösning på 8 Mb. Från provförvärv till slutrapport kräver arbetsprocessen flera steg med nära efterlevnad av protokoll. Eftersom olika kritiska steg kan avgöra resultatet av förstärkning, bibliotekets kvalitet, täckning av läsningar och utmatning av data, kan beskrivande information med annan visuell demonstration än ord ge mer detaljer till operationen och manipulationen, vilket kan ha stor inverkan på resultaten av alla kritiska steg. Metoderna som presenteras häri kommer att visa de procedurer som är involverade i helgenomförstärkning (WGA) av biopsierade Trophectoderm (TE) -celler, genomisk bibliotekskonstruktion, sequencerhantering och slutligen generera kopieringsnummervarianters rapporter.
Aneuploidi är abnormiteten i antalet kromosomer genom närvaron av en eller flera extra kromosomer eller frånvaron av en eller flera kromosomer. Embryon som bär någon typ av aneuploidi, såsom förlust av en X-kromosom (Turners syndrom), extra kopior av autosomer, som trisomier av autosom 21 (Downs syndrom), 13 (Patau syndrom) och 18 (Edwards syndrom) eller extra könskromosomer som 47, XXY (Klinefelters syndrom) och 47, XXX (Triple X syndrom), kan överleva till termin med fosterskador1. Aneuploidi är den främsta orsaken till missfall i första trimestern och provrörsbefruktning (IVF) misslyckande2. Det rapporteras att aneuploidihastigheten kan variera från 25,4% -84,5% genom de olika åldersskikten i den naturliga cykeln och den medicinska kontrollgruppen i IVF-övning3.
Nästa generations sekvenseringsteknik blir vilt tillämpad vid bestämning av genetisk information kliniskt; Det ger praktisk tillgång till genomsekvens med effektivitet och hög genomströmning. Särskilt nästa generations sekvensering revolutionerade också diagnosen störningar med genetiska faktorer och tester för abnormitet i genomet4. Med hjälp av halvledarsekvenseringsteknik för att direkt överföra kemiska signaler vid sekvensering av bioreaktion till digitala data, ger det halvledarbaserade sekvenssystemet en direkt realtidsdetektering för sekvensdata i 3-7 h 5,6.
I ett IVF-förfarande undersöker preimplantatorisk genetisk testning (PGT) embryots genetiska profil innan det överförs till livmodern för att förbättra IVF-resultatet och minska risken för genetiska störningar hos nyfödda 1,7. I PGT i kombination med NGS-tekniker förstärks genetiskt material extraherat från mindre än 10 celler med helgenomförstärkningssatser eller ett oberoende utvecklat helgenomförstärkningsreagens. Detta kräver bara ett steg i förstärkningsfasen och kräver inte förförstärkning för att erhålla helgenomförstärkningsprodukter. Primers eller paneler för copy number variant och speciell gene loci sekvensering designas och tillämpas i det bibliotek som konstruerats.
Ett typiskt arbetsflöde för preimplantatorisk genetisk testning-aneuploidi (PGT-A) i NGS involverar seriella procedurer och kräver en intensiv arbetsbelastning av laboratoriepersonal8. Vissa feloperationer orsakade proceduråterställning kan leda till oönskad förlust av både tid och resurser för labbet. En kortfattad och tydlig standardprocedur (SOP) för PGS-NGS-arbetsflöde är till hjälp; Word-formatprotokoll kan dock inte presentera mer detaljerad information om provbearbetning, enhetsmanipulation och instrumentinställningar, som kan visualiseras i ett videoprotokoll. I den här artikeln kan ett validerat arbetsflöde i kombination med en visualiserad demonstration av driftsdetaljer erbjuda mer direkta och intuitiva hänvisningsprotokoll i PGT-praxis på en halvledarsekvenseringsplattform.
Protokollet beskriver här en metod som stöder batchning av upp till 16 embryobiopsier parallellt. För större satser rekommenderas att man använder ett kommersiellt kitbaserat protokoll för halvledarsekvensering, till exempel Reproes-PGS.
Kromosomal aneuploidi hos embryon är orsaken till en stor del av graviditetsförlusten, oavsett om den är tänkt naturligt eller in vitro-befruktning (IVF). I klinisk praxis för IVF föreslås att screening av embryot aneuploidi och överföring av euploidiembryot kan förbättra resultatet av IVF. Fluorescens in situ hybridisering är den tidigaste tekniken som antagits för könsselektion och PGT-A; Denna teknik kräver dock mer teknisk expertis från laboratoriepersonal och är relativt arbetsinte…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr. Zhangyong Ming och Mr. Rongji Hou för deras råd om LIMS utökade ansökan. Denna studie stöds av PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) och Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).
0.45 μm Syringe Filter Unit | Merkmillipore | Millex-HV | |
1.5 mL DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
15 mL tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
2.0 mLDNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108078 | |
50 mL tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
Anstart Tap DNA Polymerase | FAPON | ||
AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
Cell Lysis buffer | Southern Medical University | Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS | |
ClinVar | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ | |
DNA elution buffer | NEB | T1016L | |
dNTP | Vazyme | P031-AA | |
DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
Ethyl alcohol | Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific | http://www.chemicalreagent.com/ | |
Independently developed whole genome amplification reagents | Southern Medical University | The reagents consist of the following components: 1. Cell Lysis 2. Amplification Pre-mixed solution 1) Primer WGA-P2 (10 μM) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 3. Amplification Enzyme 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL) |
|
Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit mentioned in step 4.2.8 |
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
Ion Proton System | Life Technologies | 4476610 | |
Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
isopropanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | http://www.chemicalreagent.com/ | |
Library Preparation Kit | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9932 | |
Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3' |
|
OneTouch 2 System | Life Technologies | 4474779 | Template amplification and enrichment system |
PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
Pipette tips | Quality Scientific Products | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
Portable Mini Centrifuge LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Fluorometer |
Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
Sequencer server system | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
Sequencing Reactions Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html This kit contains the following components: 1. Template Preparation Kit Set 1.1 Template Preparation Kit: Emulsion PCR buffer Emulsion PCR enzyme mix Template carrier solution 1.2 Template Preparation solutions: Template preparation reaction oil I emulsifier breaking solution II Template Preparation Reaction Oil II Nuclease-free water Tween solution Demulsification solution I Template washing solution C1 bead washing solution C1 bead resuspension solution Template resuspension solution 1.3 Template Preparation Materials: Reagent tube I connector Collection tube Reagent tube pipette I Amplification plate 8 wells strip Dedicated tips Template preparation washing adapter Template preparation filter 2. Sequencing Kit Set 2.1 Sequencing Kit: dGTP dCTP dATP dTTP Sequencing enzyme solution Sequencing primers Quality control templates 2.2 Sequencing Solutions: Sequencing solution II Sequencing solution IIII Annealing buffer Loading buffer Foaming agent Chlorine tablets C1 bead 2.3 Sequencing Materials: Reagent Tube II Reagent tube cap Reagent tube sipper II Reagent bottle sipper Reagent bottles 3. Chip |
Sodium hydroxide solution | Sigma | 72068-100ML | |
Thermal Cycler | Life Technologies | 4375786 |