Caracterização tridimensional de Sítios de Contato Interorganelle em Hepatócitos usando Microscopia eletrônica de seção serial

Summary

Um protocolo simples e abrangente para adquirir detalhes tridimensionais de locais de contato de membrana entre organelas em hepatócitos do fígado ou células em outros tecidos.

Abstract

A microscopia eletrônica de transmissão tem sido considerada por muito tempo o padrão-ouro para a visualização da ultraestrutura celular. No entanto, a análise é muitas vezes limitada a duas dimensões, dificultando a capacidade de descrever totalmente a ultraestrutura tridimensional (3D) e a relação funcional entre organelas. A microscopia eletrônica de volume (vEM) descreve uma coleção de técnicas que permitem o interrogatório da ultraestrutura celular em 3D em resoluções de mesoescala, microescala e nanoescala.

Este protocolo fornece um método acessível e robusto para adquirir dados vEM usando a transmissão de seção serial EM (TEM) e abrange os aspectos técnicos do processamento de amostras até a reconstrução 3D digital em um único e simples fluxo de trabalho. Para demonstrar a utilidade dessa técnica, apresenta-se a relação ultraestrutural 3D entre o regúrio endoplasmático e mitocôndrias e seus locais de contato em hepatócitos hepáticos. Os contatos interorganelle servem papéis vitais na transferência de íons, lipídios, nutrientes e outras pequenas moléculas entre organelas. No entanto, apesar de sua descoberta inicial em hepatócitos, ainda há muito a aprender sobre suas características físicas, dinâmicas e funções.

Os contatos de Interorganelle podem exibir uma gama de morfologias, variando na proximidade das duas organelas umas com as outras (tipicamente ~10-30 nm) e a extensão do local de contato (de contatos pontuados a contatos cisternas maiores). O exame de contatos próximos requer imagens de alta resolução, e a seção serial TEM é adequada para visualizar a ultraestruturação 3D de contatos interorganelle durante a diferenciação de hepatócitos, bem como alterações na arquitetura hepatócito associada a doenças metabólicas.

Introduction

Desde sua invenção na década de 1930, microscópios eletrônicos permitiram aos pesquisadores visualizar os componentes estruturais das células e tecidos ^1,2. A maioria das investigações forneceu informações 2D, pois a construção de modelos 3D requer uma minuciosa coleção de seções seriais, fotografia manual, processamento negativo, rastreamento manual e a criação e montagem de modelos 3D a partir de folhas de vidro, plástico ou isopor ^3,4. Quase 70 anos depois, houve avanços consideráveis em inúmeros aspectos do processo, desde o desempenho do microscópio, coleta de seções seriais, imagem digital automatizada, software e hardware sofisticados para reconstrução 3D, visualização e análise até abordagens alternativas para o que agora é chamado coletivamente de volume EM (vEM). Essas técnicas de vEM são geralmente consideradas para fornecer informações ultraestruturais 3D em resoluções de nanômetros através de escalas de micron e englobar as técnicas de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e novas técnicas de microscopia eletrônica de varredura (SEM); ver avaliações 5,6,7,8.

Por exemplo, o feixe de íons focados SEM (FIB-SEM) usa um feixe de íons focado dentro de um SEM para frear a superfície do bloco entre imagens sem sequenciais da superfície do bloco, permitindo a repetida fresagem/imagem automatizada de uma amostra e construindo um conjunto de dados 3D para reconstrução ^9,10. Em contrapartida, a face de bloco serial SEM (SBF-SEM) usa um ultramicrotome dentro do SEM para remover material da face do bloco antes da imagem^11,12, enquanto a tomografia de matriz é um processo não destrutivo que requer a coleta de seções seriais, em clipes de cobertura, wafers ou fita, antes de configurar um fluxo de trabalho automatizado de imagem da região de interesse em seções sequenciais no MEI para gerar os dados^{3Dset 13} . Semelhante à tomografia de matriz, a seção serial TEM (ssTEM) requer que seções físicas sejam coletadas antes da imagem; no entanto, essas seções são coletadas em grades TEM e imagens em um TEM 14,15,16. ssTEM pode ser estendido realizando tomografia inclinada 17,18,19. A tomografia de inclinação serial fornece a melhor resolução em x, y e z, e embora tenha sido usada para reconstruir células inteiras²⁰, é razoavelmente desafiadora. Este protocolo se concentra nos aspectos práticos do SSTEM como a técnica vEM mais acessível disponível para muitos laboratórios EM que podem não ter acesso a seção especializada ou instrumentos vEM, mas se beneficiariam da geração de dados vEM 3D.

A ultramicrotomia serial para reconstrução 3D já foi considerada desafiadora. Era difícil cortar fitas retas de espessura de seção uniforme, ser capaz de organizar e pegar fitas do tamanho correto, na ordem correta, em grades com suporte suficiente, mas sem grades de grade obscurecendo regiões de interesse, e o mais importante, sem perder seções, pois uma série incompleta pode impedir a reconstrução 3D completa²¹. No entanto, melhorias nos ultrassoms comerciais, corte de diamantes e facas^{de corte 22,23}, filmes de suporte lucente de elétrons nas grades^21,24, e adesivos para auxiliar a adesão de seção e preservação da fita^13,21 são apenas alguns dos avanços incrementais ao longo dos anos que tornaram a técnica mais rotineira em muitos laboratórios. Uma vez coletadas seções seriais, a imagem serial no TEM é simples e pode fornecer imagens EM com tamanhos px subnanômetros em x e y, permitindo interrogatórios de alta resolução das estruturas subcelulares – um requisito potencial para muitas questões de pesquisa. O estudo de caso aqui apresentado demonstra o uso de ssTEM e reconstrução 3D no estudo de contatos endoplasmicas de rcístulo (ER)-organela em hepatócitos hepáticos, onde os contatos ER-organela foram observados pela primeira vez^25,26.

Apesar de ser contíguo com o envelope nuclear, o ER também faz contatos próximos com inúmeras outras organelas celulares, incluindo lysosomes, mitocôndrias, gotículas lipídicas e a membrana plasmática²⁷. Os contatos er-organela foram implicados no metabolismo lipídico²⁸, fosfoinostito e sinalização de cálcio²⁹, regulação da autofagia e resposta ao estresse^30,31. Os contatos er-organela e outros contatos interorganelle são estruturas altamente dinâmicas que respondem às necessidades metabólicas celulares e pistas extracelulares. Eles têm sido mostrados variando morfologicamente em seu tamanho e forma e as distâncias entre as membranas organela^32,33. Acredita-se que essas diferenças ultraestruturais provavelmente refletem suas diferentes composições proteicas/lipídicas e funcionam^34,35. No entanto, ainda é uma tarefa desafiadora definir contatos interorganelle e analisá-los³⁶. Por isso, é necessário um protocolo confiável, porém simples, para examinar e caracterizar contatos interorganelle para investigações posteriores.

Como os contatos er-organela podem variar de 10 a 30 nm na separação membrana-membrana, o padrão-ouro para identificação tem sido historicamente TEM. O TEM de seção fina revelou localização específica de subdomínios para proteínas de ER residentes em contatos de membrana^{distinta 37}. Tradicionalmente, isso tem revelado contatos er-organela com resolução nm, mas muitas vezes apenas apresentou uma visão 2D dessas interações. No entanto, as abordagens vEM revelam a apresentação ultraestrutural e o contexto desses sites de contato em 3D, permitindo a reconstrução completa dos contatos e classificação mais precisa de contatos (ponto vs. tubular vs. cisterna-like) e quantificação^38,39. Além de ser o primeiro tipo de célula onde foram observados contatos ER-organela^25,26, os hepatócitos possuem um extenso sistema de outros contatos interorganelles que servem a papéis vitais em sua arquitetura e fisiologia^28,40. No entanto, ainda falta uma caracterização morfológica completa da ER-organela e de outros contatos interorganelles em hepatócitos. Assim, como os contatos interorganelle formam e remodelam durante a regeneração e reparação é de particular relevância para a biologia hepatocita e função hepática.

Protocol

Todos os animais foram alojados de acordo com as diretrizes do Ministério do Interior do Reino Unido, e a colheita de tecidos foi realizada de acordo com a Lei de Animais (Procedimentos Científicos) do Reino Unido de 1986. 1. Fixação e preparação de espécimes Disseque o tecido hepático em pedaços de tamanho apropriado, aproximadamente 8 mm x 8 mm x 3 mm, e coloque as peças em soro fisco tamponado quente (PBS, 37 °C). Injete temperatura ambiente (…

Representative Results

Para esta técnica, as regiões de interesse são selecionadas com base no objetivo de pesquisa biológica e identificadas antes do corte e secção do tecido incorporado. Da mesma forma, o tamanho da face do bloco pode ser ditado pela questão da pesquisa; neste caso, a amostra foi aparada para deixar uma face de bloco de aproximadamente 0,3 mm x 0,15 mm (Figura 4A). Isso permitiu duas grades de 9 seções seriais por grade, fornecendo 18 seções seriais e incorporando um volume de tecido …

Discussion

Uma técnica vEM acessível para visualizar a estrutura organela e interações em 3D é descrita neste protocolo. A morfologia dos contatos interorganelle em hepatócitos é apresentada como um estudo de caso aqui. No entanto, essa abordagem também tem sido aplicada para investigar uma variedade de outras amostras e áreas de pesquisa, incluindo interações endoteliais de células schwann em nervos periféricos⁴⁵, biogênese corporal weibel palade em células endoteliais^46</su…

Materials

0.22 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
Aluminum trays	Agar Scientific	AGG3912
Amira v6	ThermoFisher		https://www.thermofisher.com
Chloroform	Fisher	C/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride	TAAB	T027	Epon ingredient
Diamond knife	DiaTOME	ultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol	TAAB	D032	Epon ingredient
Dumont Tweezers N5	Agar Scientific	AGT5293
Fiji			https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 plugin			https://imagej.net/
Formaldehyde 36% solution	TAAB	F003
Formvar coated slot grid	Homemade		Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)
Glass bottle with applicator rod	Medisca	6258
Glass vials	Fisher Scientific	15364769
Gluteraldehyde 25% solution	TAAB	G011
MNA/Methyl Nadic Anhydride	TAAB	M011	Epon ingredient
Osmium Tetroxide 2% solution	TAAB	O005
Potassium Ferricyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene oxide	Fisher Scientific	E/0050/PB08
Reuseable adhesive	Blue Tack
Reynolds Lead Citrate	TAAB	L037	Section stain
Sodium Cacodylate	Sigma-Aldrich	C-0250	to make 0.1 M Caco buffer
Super Glue	RS Components	918-6872	Cyanoacrylate glue, Step 1.3
TAAB 812 Resin	TAAB	T023	Epon ingredient
Tannic acid	TAAB	T046
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Two part Epoxy Resin	RS Components	132-605	Alternative: Step 2.13
Ultramicrotome	Leica	UC7
Vibrating microtome	Leica		100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .
Weldwood Original Contact cement	DAP	107	Contact adhesive: Step 3.1.4