Um protocolo simples e abrangente para adquirir detalhes tridimensionais de locais de contato de membrana entre organelas em hepatócitos do fígado ou células em outros tecidos.
A microscopia eletrônica de transmissão tem sido considerada por muito tempo o padrão-ouro para a visualização da ultraestrutura celular. No entanto, a análise é muitas vezes limitada a duas dimensões, dificultando a capacidade de descrever totalmente a ultraestrutura tridimensional (3D) e a relação funcional entre organelas. A microscopia eletrônica de volume (vEM) descreve uma coleção de técnicas que permitem o interrogatório da ultraestrutura celular em 3D em resoluções de mesoescala, microescala e nanoescala.
Este protocolo fornece um método acessível e robusto para adquirir dados vEM usando a transmissão de seção serial EM (TEM) e abrange os aspectos técnicos do processamento de amostras até a reconstrução 3D digital em um único e simples fluxo de trabalho. Para demonstrar a utilidade dessa técnica, apresenta-se a relação ultraestrutural 3D entre o regúrio endoplasmático e mitocôndrias e seus locais de contato em hepatócitos hepáticos. Os contatos interorganelle servem papéis vitais na transferência de íons, lipídios, nutrientes e outras pequenas moléculas entre organelas. No entanto, apesar de sua descoberta inicial em hepatócitos, ainda há muito a aprender sobre suas características físicas, dinâmicas e funções.
Os contatos de Interorganelle podem exibir uma gama de morfologias, variando na proximidade das duas organelas umas com as outras (tipicamente ~10-30 nm) e a extensão do local de contato (de contatos pontuados a contatos cisternas maiores). O exame de contatos próximos requer imagens de alta resolução, e a seção serial TEM é adequada para visualizar a ultraestruturação 3D de contatos interorganelle durante a diferenciação de hepatócitos, bem como alterações na arquitetura hepatócito associada a doenças metabólicas.
Desde sua invenção na década de 1930, microscópios eletrônicos permitiram aos pesquisadores visualizar os componentes estruturais das células e tecidos 1,2. A maioria das investigações forneceu informações 2D, pois a construção de modelos 3D requer uma minuciosa coleção de seções seriais, fotografia manual, processamento negativo, rastreamento manual e a criação e montagem de modelos 3D a partir de folhas de vidro, plástico ou isopor 3,4. Quase 70 anos depois, houve avanços consideráveis em inúmeros aspectos do processo, desde o desempenho do microscópio, coleta de seções seriais, imagem digital automatizada, software e hardware sofisticados para reconstrução 3D, visualização e análise até abordagens alternativas para o que agora é chamado coletivamente de volume EM (vEM). Essas técnicas de vEM são geralmente consideradas para fornecer informações ultraestruturais 3D em resoluções de nanômetros através de escalas de micron e englobar as técnicas de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e novas técnicas de microscopia eletrônica de varredura (SEM); ver avaliações 5,6,7,8.
Por exemplo, o feixe de íons focados SEM (FIB-SEM) usa um feixe de íons focado dentro de um SEM para frear a superfície do bloco entre imagens sem sequenciais da superfície do bloco, permitindo a repetida fresagem/imagem automatizada de uma amostra e construindo um conjunto de dados 3D para reconstrução 9,10. Em contrapartida, a face de bloco serial SEM (SBF-SEM) usa um ultramicrotome dentro do SEM para remover material da face do bloco antes da imagem11,12, enquanto a tomografia de matriz é um processo não destrutivo que requer a coleta de seções seriais, em clipes de cobertura, wafers ou fita, antes de configurar um fluxo de trabalho automatizado de imagem da região de interesse em seções sequenciais no MEI para gerar os dados3Dset 13 . Semelhante à tomografia de matriz, a seção serial TEM (ssTEM) requer que seções físicas sejam coletadas antes da imagem; no entanto, essas seções são coletadas em grades TEM e imagens em um TEM 14,15,16. ssTEM pode ser estendido realizando tomografia inclinada 17,18,19. A tomografia de inclinação serial fornece a melhor resolução em x, y e z, e embora tenha sido usada para reconstruir células inteiras20, é razoavelmente desafiadora. Este protocolo se concentra nos aspectos práticos do SSTEM como a técnica vEM mais acessível disponível para muitos laboratórios EM que podem não ter acesso a seção especializada ou instrumentos vEM, mas se beneficiariam da geração de dados vEM 3D.
A ultramicrotomia serial para reconstrução 3D já foi considerada desafiadora. Era difícil cortar fitas retas de espessura de seção uniforme, ser capaz de organizar e pegar fitas do tamanho correto, na ordem correta, em grades com suporte suficiente, mas sem grades de grade obscurecendo regiões de interesse, e o mais importante, sem perder seções, pois uma série incompleta pode impedir a reconstrução 3D completa21. No entanto, melhorias nos ultrassoms comerciais, corte de diamantes e facasde corte 22,23, filmes de suporte lucente de elétrons nas grades21,24, e adesivos para auxiliar a adesão de seção e preservação da fita13,21 são apenas alguns dos avanços incrementais ao longo dos anos que tornaram a técnica mais rotineira em muitos laboratórios. Uma vez coletadas seções seriais, a imagem serial no TEM é simples e pode fornecer imagens EM com tamanhos px subnanômetros em x e y, permitindo interrogatórios de alta resolução das estruturas subcelulares – um requisito potencial para muitas questões de pesquisa. O estudo de caso aqui apresentado demonstra o uso de ssTEM e reconstrução 3D no estudo de contatos endoplasmicas de rcístulo (ER)-organela em hepatócitos hepáticos, onde os contatos ER-organela foram observados pela primeira vez25,26.
Apesar de ser contíguo com o envelope nuclear, o ER também faz contatos próximos com inúmeras outras organelas celulares, incluindo lysosomes, mitocôndrias, gotículas lipídicas e a membrana plasmática27. Os contatos er-organela foram implicados no metabolismo lipídico28, fosfoinostito e sinalização de cálcio29, regulação da autofagia e resposta ao estresse30,31. Os contatos er-organela e outros contatos interorganelle são estruturas altamente dinâmicas que respondem às necessidades metabólicas celulares e pistas extracelulares. Eles têm sido mostrados variando morfologicamente em seu tamanho e forma e as distâncias entre as membranas organela32,33. Acredita-se que essas diferenças ultraestruturais provavelmente refletem suas diferentes composições proteicas/lipídicas e funcionam34,35. No entanto, ainda é uma tarefa desafiadora definir contatos interorganelle e analisá-los36. Por isso, é necessário um protocolo confiável, porém simples, para examinar e caracterizar contatos interorganelle para investigações posteriores.
Como os contatos er-organela podem variar de 10 a 30 nm na separação membrana-membrana, o padrão-ouro para identificação tem sido historicamente TEM. O TEM de seção fina revelou localização específica de subdomínios para proteínas de ER residentes em contatos de membranadistinta 37. Tradicionalmente, isso tem revelado contatos er-organela com resolução nm, mas muitas vezes apenas apresentou uma visão 2D dessas interações. No entanto, as abordagens vEM revelam a apresentação ultraestrutural e o contexto desses sites de contato em 3D, permitindo a reconstrução completa dos contatos e classificação mais precisa de contatos (ponto vs. tubular vs. cisterna-like) e quantificação38,39. Além de ser o primeiro tipo de célula onde foram observados contatos ER-organela25,26, os hepatócitos possuem um extenso sistema de outros contatos interorganelles que servem a papéis vitais em sua arquitetura e fisiologia28,40. No entanto, ainda falta uma caracterização morfológica completa da ER-organela e de outros contatos interorganelles em hepatócitos. Assim, como os contatos interorganelle formam e remodelam durante a regeneração e reparação é de particular relevância para a biologia hepatocita e função hepática.
Uma técnica vEM acessível para visualizar a estrutura organela e interações em 3D é descrita neste protocolo. A morfologia dos contatos interorganelle em hepatócitos é apresentada como um estudo de caso aqui. No entanto, essa abordagem também tem sido aplicada para investigar uma variedade de outras amostras e áreas de pesquisa, incluindo interações endoteliais de células schwann em nervos periféricos45, biogênese corporal weibel palade em células endoteliais46</su…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro e Ania Straatman-Iwanowska pela assistência técnica especializada. Agradecemos aos membros do laboratório Stefan e Ian J. White por discussões úteis. J.J.B. é apoiado pelo financiamento da MRC para o MrC Laboratory of Molecular Cell Biology na UCL, MC_U12266B de código de premiação. C.J.S. é apoiado pelo financiamento da MRC para o MrC Laboratory of Molecular Cell Biology University Unit na UCL, código de premiação MC_UU_00012/6. P.G. é financiado pelo Conselho Europeu de Pesquisa, código de concessão ERC-2013-StG-337057.
0.22 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
Aluminum trays | Agar Scientific | AGG3912 | |
Amira v6 | ThermoFisher | https://www.thermofisher.com | |
Chloroform | Fisher | C/4960/PB08 | |
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride | TAAB | T027 | Epon ingredient |
Diamond knife | DiaTOME | ultra 45° | |
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol | TAAB | D032 | Epon ingredient |
Dumont Tweezers N5 | Agar Scientific | AGT5293 | |
Fiji | https://imagej.net/ | ||
Fiji TrakEM2 plugin | https://imagej.net/ | ||
Formaldehyde 36% solution | TAAB | F003 | |
Formvar coated slot grid | Homemade | Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu) | |
Glass bottle with applicator rod | Medisca | 6258 | |
Glass vials | Fisher Scientific | 15364769 | |
Gluteraldehyde 25% solution | TAAB | G011 | |
MNA/Methyl Nadic Anhydride | TAAB | M011 | Epon ingredient |
Osmium Tetroxide 2% solution | TAAB | O005 | |
Potassium Ferricyanide | Sigma-Aldrich | P-8131 | |
Propylene oxide | Fisher Scientific | E/0050/PB08 | |
Reuseable adhesive | Blue Tack | ||
Reynolds Lead Citrate | TAAB | L037 | Section stain |
Sodium Cacodylate | Sigma-Aldrich | C-0250 | to make 0.1 M Caco buffer |
Super Glue | RS Components | 918-6872 | Cyanoacrylate glue, Step 1.3 |
TAAB 812 Resin | TAAB | T023 | Epon ingredient |
Tannic acid | TAAB | T046 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Two part Epoxy Resin | RS Components | 132-605 | Alternative: Step 2.13 |
Ultramicrotome | Leica | UC7 | |
Vibrating microtome | Leica | 100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude . | |
Weldwood Original Contact cement | DAP | 107 | Contact adhesive: Step 3.1.4 |