Tredimensionel karakterisering af interorganelle kontaktsteder i hepatocytter ved hjælp af seriel sektionselektronmikroskopi

Summary

En enkel og omfattende protokol til at erhverve tredimensionelle detaljer om membrankontaktsteder mellem organeller i hepatocytter fra leveren eller celler i andre væv.

Abstract

Transmissionselektronmikroskopi har længe været anset for at være guldstandarden for visualisering af cellulær ultrastruktur. Imidlertid er analysen ofte begrænset til to dimensioner, hvilket hæmmer evnen til fuldt ud at beskrive den tredimensionelle (3D) ultrastruktur og det funktionelle forhold mellem organeller. Volumenelektronmikroskopi (vEM) beskriver en samling teknikker, der muliggør forhør af cellulær ultrastruktur i 3D ved mesoskala, mikroskala og nanoskalaopløsninger.

Denne protokol giver en tilgængelig og robust metode til at erhverve vEM-data ved hjælp af seriel sektionstransmission EM (TEM) og dækker de tekniske aspekter af prøvebehandling til digital 3D-rekonstruktion i en enkelt, ligetil arbejdsgang. For at demonstrere nytten af denne teknik præsenteres det ultrastrukturelle 3D-forhold mellem det endoplasmatiske retikulum og mitokondrier og deres kontaktsteder i leverhenpatocytter. Interorganelle kontakter tjener vitale roller i overførslen af ioner, lipider, næringsstoffer og andre små molekyler mellem organeller. På trods af deres første opdagelse i hepatocytter er der dog stadig meget at lære om deres fysiske egenskaber, dynamik og funktioner.

Interorganelle kontakter kan vise en række morfologier, der varierer i nærheden af de to organeller til hinanden (typisk ~ 10-30 nm) og omfanget af kontaktstedet (fra punkterede kontakter til større 3D-cisternallignende kontakter). Undersøgelsen af nære kontakter kræver billeddannelse i høj opløsning, og seriel sektion TEM er velegnet til at visualisere 3D ultrastrukturelle af interorganelle kontakter under hepatocytdifferentiering samt ændringer i hepatocytarkitektur forbundet med metaboliske sygdomme.

Introduction

Siden deres opfindelse i 1930’erne har elektronmikroskoper gjort det muligt for forskere at visualisere de strukturelle komponenter i celler og væv ^1,2. De fleste undersøgelser har givet 2D-oplysninger, da bygning af 3D-modeller kræver omhyggelig seriel sektionsindsamling, manuel fotografering, negativ behandling, manuel sporing og oprettelse og samling af 3D-modeller fra plader af glas, plast eller Styrofoam ^3,4. Næsten 70 år senere har der været betydelige fremskridt inden for adskillige aspekter af processen, fra mikroskopydelse, seriel sektionsindsamling, automatiseret digital billeddannelse, sofistikeret software og hardware til 3D-rekonstruktion, visualisering og analyse til alternative tilgange til det, der nu kollektivt kaldes volumen EM (vEM). Disse vEM-teknikker anses generelt for at give 3D ultrastrukturel information ved nanometeropløsninger på tværs af mikronskalaer og omfatter transmissionselektronmikroskopi (TEM) og nyere scanningselektronmikroskopi (SEM) teknikker; se anmeldelser 5,6,7,8.

For eksempel bruger fokuseret ionstråle SEM (FIB-SEM) en fokuseret ionstråle inde i en SEM til at fræse overfladen af blokken væk mellem sekventielle SEM-billeddannelsesscanninger af blokkens overflade, hvilket muliggør gentagen automatiseret fræsning / billeddannelse af en prøve og opbygning af et 3D-datasæt til rekonstruktion ^9,10. I modsætning hertil bruger seriel blokfladen SEM (SBF-SEM) et ultramikrotom inde i SEM til at fjerne materiale fra blokfladen inden billeddannelse ^11,12, mens arraytomografi er en ikke-destruktiv proces, der kræver indsamling af serielle sektioner på dæksedler, wafers eller tape, inden der oprettes en automatiseret arbejdsgang til billeddannelse af det område, der er af interesse i sekventielle sektioner i SEM for at generere 3D-datasættet¹³ . I lighed med arraytomografi kræver seriel sektion TEM (ssTEM), at fysiske sektioner indsamles forud for billeddannelse; Disse sektioner er dog samlet på TEM-gitre og afbildet i en TEM 14,15,16. ssTEM kan udvides ved at udføre vippetomografi 17,18,19. Seriel vippetomografi giver den bedste opløsning i x, y og z, og selvom den er blevet brugt til at rekonstruere hele celler²⁰, er det rimeligt udfordrende. Denne protokol fokuserer på de praktiske aspekter af ssTEM som den mest tilgængelige vEM-teknik, der er tilgængelig for mange EM-laboratorier, der muligvis ikke i øjeblikket har adgang til specialiserede sektionerings- eller vEM-instrumenter, men ville drage fordel af at generere 3D vEM-data.

Seriel ultramikrotomi til 3D-rekonstruktion er tidligere blevet betragtet som udfordrende. Det var vanskeligt at klippe lige bånd af jævn sektionstykkelse, være i stand til at arrangere og afhente bånd af den rigtige størrelse i den rigtige rækkefølge på gitter med tilstrækkelig støtte, men uden gitterstænger, der skjuler områder af interesse, og vigtigst af alt uden at miste sektioner, da en ufuldstændig serie kan forhindre fuld 3D-rekonstruktion²¹. Forbedringer af kommercielle ultramikrotomer, diamantskæring og trimning af knive^22,23, elektronlumcent støttefilm på gitter^21,24 og klæbemidler til hjælp til sektionsvedhævning og båndbevarelse^13,21 er blot nogle af de trinvise fremskridt gennem årene, der har gjort teknikken mere rutinemæssig i mange laboratorier. Når serielle sektioner er indsamlet, er seriel billeddannelse i TEM ligetil og kan give EM-billeder med subnanometer px-størrelser i x og y, hvilket muliggør forhør i høj opløsning af de subcellulære strukturer – et potentielt krav til mange forskningsspørgsmål. Casestudiet, der præsenteres her, viser brugen af ssTEM og 3D-rekonstruktion i studiet af endoplasmatiske retikulum (ER)-organelkontakter i leverhæpatocytter, hvor ER-organelkontakter først blev observeret^25,26.

Mens den er sammenhængende med den nukleare kuvert, har ER også tætte kontakter med adskillige andre celleorganeller, herunder lysosomer, mitokondrier, lipiddråber og plasmamembranen²⁷. ER-organellekontakter har været impliceret i lipidmetabolisme²⁸, phosphoinositid og calciumsignalering²⁹, autofagiregulering og stressrespons^30,31. ER-organellekontakterne og andre interorganelle kontakter er meget dynamiske strukturer, der reagerer på cellulære metaboliske behov og ekstracellulære signaler. De har vist sig at variere morfologisk i deres størrelse og form og afstanden mellem organelmembraner^32,33. Det menes, at disse ultrastrukturelle forskelle sandsynligvis afspejler deres forskellige protein / lipidsammensætninger og funktion^34,35. Det er dog stadig en udfordrende opgave at definere interorganelle kontakter og analysere dem³⁶. Derfor kræves en pålidelig, men enkel protokol til undersøgelse og karakterisering af interorganelle kontakter til yderligere undersøgelser.

Da ER-organellekontakter kan variere fra 10 til 30 nm i membran-til-membran-adskillelse, har guldstandarden for identifikation historisk været TEM. Tynd sektion TEM har afsløret specifik underdomænelokalisering for residente ER-proteiner ved forskellige membrankontakter³⁷. Traditionelt har dette afsløret ER-organellekontakter med nm-opløsning, men ofte kun præsenteret et 2D-billede af disse interaktioner. VEM-tilgange afslører imidlertid den ultrastrukturelle præsentation og kontekst af disse kontaktsteder i 3D, hvilket muliggør fuld rekonstruktion af kontakter og mere nøjagtig klassificering af kontakter (punkt vs. rørformet vs. cisternallignende) og kvantificering ^38,39. Ud over at være den første celletype, hvor ER-organelkontakter blev observeret^25,26, har hepatocytter et omfattende system af andre interorganelle kontakter, der tjener vitale roller i deres arkitektur og fysiologi ^28,40. Imidlertid mangler der stadig en grundig morfologisk karakterisering af ER-organelle og andre interorganelle kontakter i hepatocytter. Følgelig er det af særlig relevans for hepatocytbiologi og leverfunktion, hvordan interorganelle kontakter dannes og ombygges under regenerering og reparation.

Protocol

Alle dyr blev opholdt i overensstemmelse med det britiske indenrigsministeriums retningslinjer, og vævshøsten blev udført i overensstemmelse med UK Animal (Scientific Procedures) Act 1986. 1. Prøvefiksering og tilberedning Levervævet dissekeres i stykker af passende størrelse, ca. 8 mm x 8 mm x 3 mm, og stykkerne anbringes i varmt fosfatbufret saltvand (PBS, 37 °C). Injicer stuetemperatur (20-25 °C) fikseringsmiddel (1,5% glutaraldehyd i 1% saccharo…

Representative Results

Til denne teknik udvælges regioner af interesse baseret på det biologiske forskningsmål og identificeres inden trimning og sektionering af indlejret væv. Tilsvarende kan størrelsen på blokfladen dikteres af forskningsspørgsmålet; i dette tilfælde blev prøven trimmet for at efterlade en blokside på ca. 0,3 mm x 0,15 mm (figur 4A). Dette tillod to gitter med 9 serielle sektioner pr. gitter, der gav 18 serielle sektioner og inkorporerede et volumen levervæv med et volumen på ca. 62…

Discussion

En tilgængelig vEM-teknik til visualisering af organelstruktur og interaktioner i 3D er beskrevet i denne protokol. Morfologien af interorganelle kontakter i hepatocytter præsenteres som et casestudie her. Denne tilgang er imidlertid også blevet anvendt til at undersøge en række andre prøver og forskningsområder, herunder Schwann-celle-endotelinteraktioner i perifere nerver⁴⁵, Weibel Palade Body biogenese i endotelceller⁴⁶, lastsekretion i nyreceller<sup class="xref"…

Materials

0.22 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
Aluminum trays	Agar Scientific	AGG3912
Amira v6	ThermoFisher		https://www.thermofisher.com
Chloroform	Fisher	C/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride	TAAB	T027	Epon ingredient
Diamond knife	DiaTOME	ultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol	TAAB	D032	Epon ingredient
Dumont Tweezers N5	Agar Scientific	AGT5293
Fiji			https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 plugin			https://imagej.net/
Formaldehyde 36% solution	TAAB	F003
Formvar coated slot grid	Homemade		Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)
Glass bottle with applicator rod	Medisca	6258
Glass vials	Fisher Scientific	15364769
Gluteraldehyde 25% solution	TAAB	G011
MNA/Methyl Nadic Anhydride	TAAB	M011	Epon ingredient
Osmium Tetroxide 2% solution	TAAB	O005
Potassium Ferricyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene oxide	Fisher Scientific	E/0050/PB08
Reuseable adhesive	Blue Tack
Reynolds Lead Citrate	TAAB	L037	Section stain
Sodium Cacodylate	Sigma-Aldrich	C-0250	to make 0.1 M Caco buffer
Super Glue	RS Components	918-6872	Cyanoacrylate glue, Step 1.3
TAAB 812 Resin	TAAB	T023	Epon ingredient
Tannic acid	TAAB	T046
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Two part Epoxy Resin	RS Components	132-605	Alternative: Step 2.13
Ultramicrotome	Leica	UC7
Vibrating microtome	Leica		100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .
Weldwood Original Contact cement	DAP	107	Contact adhesive: Step 3.1.4