Dreidimensionale Charakterisierung von interorganellen Kontaktstellen in Hepatozyten mittels serieller Schnittelektronenmikroskopie

Summary

Ein einfaches und umfassendes Protokoll, um dreidimensionale Details von Membrankontaktstellen zwischen Organellen in Hepatozyten aus der Leber oder Zellen in anderen Geweben zu erfassen.

Abstract

Die Transmissionselektronenmikroskopie gilt seit langem als Goldstandard für die Visualisierung zellulärer Ultrastrukturen. Die Analyse ist jedoch oft auf zwei Dimensionen beschränkt, was die Fähigkeit behindert, die dreidimensionale (3D) Ultrastruktur und die funktionelle Beziehung zwischen Organellen vollständig zu beschreiben. Die Volumenelektronenmikroskopie (vEM) beschreibt eine Sammlung von Techniken, die die Abfrage der zellulären Ultrastruktur in 3D bei mesoskaligen, mikroskaligen und nanoskaligen Auflösungen ermöglichen.

Dieses Protokoll bietet eine zugängliche und robuste Methode zur Erfassung von vEM-Daten mittels serieller Schnittübertragung EM (TEM) und deckt die technischen Aspekte der Probenbearbeitung bis hin zur digitalen 3D-Rekonstruktion in einem einzigen, unkomplizierten Workflow ab. Um die Nützlichkeit dieser Technik zu demonstrieren, wird die ultrastrukturelle 3D-Beziehung zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und den Mitochondrien und ihren Kontaktstellen in Leberhepatozyten vorgestellt. Interorganelle Kontakte spielen eine wichtige Rolle bei der Übertragung von Ionen, Lipiden, Nährstoffen und anderen kleinen Molekülen zwischen Organellen. Trotz ihrer ersten Entdeckung in Hepatozyten gibt es jedoch noch viel über ihre physikalischen Eigenschaften, Dynamik und Funktionen zu lernen.

Interorganellenkontakte können eine Reihe von Morphologien aufweisen, die sich in der Nähe der beiden Organellen zueinander (typischerweise ~ 10-30 nm) und der Ausdehnung der Kontaktstelle (von punktuellen Kontakten bis zu größeren 3D-zisternenartigen Kontakten) unterscheiden. Die Untersuchung enger Kontakte erfordert eine hochauflösende Bildgebung, und der serielle Schnitt TEM eignet sich gut, um die ultrastrukturelle 3D-Struktur von interorganellen Kontakten während der Hepatozytendifferenzierung sowie Veränderungen in der Hepatozytenarchitektur im Zusammenhang mit Stoffwechselerkrankungen zu visualisieren.

Introduction

Seit ihrer Erfindung in den 1930er Jahren haben Elektronenmikroskope es Forschern ermöglicht, die strukturellen Bestandteile von Zellen und Geweben zu visualisieren ^1,2. Die meisten Untersuchungen haben 2D-Informationen geliefert, da das Erstellen von 3D-Modellen eine sorgfältige Sammlung serieller Abschnitte, manuelle Fotografie, Negativverarbeitung, manuelle Nachverfolgung und die Erstellung und Montage von 3D-Modellen aus Glas-, Kunststoff- oder Styropor ^3,4 erfordert. Fast 70 Jahre später gab es erhebliche Fortschritte in zahlreichen Aspekten des Prozesses, von der Mikroskopleistung, der seriellen Schnittsammlung, der automatisierten digitalen Bildgebung, der ausgefeilten Software und Hardware für die 3D-Rekonstruktion, Visualisierung und Analyse bis hin zu alternativen Ansätzen für das, was heute allgemein als Volume EM (vEM) bezeichnet wird. Es wird allgemein angenommen, dass diese vEM-Techniken ultrastrukturelle 3D-Informationen bei Nanometerauflösungen über Mikrometerskalen liefern und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und neuere Rasterelektronenmikroskopie- (REM) Techniken umfassen. Siehe Bewertungen 5,6,7,8.

Zum Beispiel verwendet der fokussierte Ionenstrahl SEM (FIB-SEM) einen fokussierten Ionenstrahl in einem REM, um die Oberfläche des Blocks zwischen sequentiellen REM-Bildaufnahmen der Blockoberfläche wegzufräsen, was das wiederholte automatisierte Fräsen / Abbilden einer Probe ermöglicht und einen 3D-Datensatz für die Rekonstruktion ^9,10 erstellt. Im Gegensatz dazu verwendet serielles Blockgesicht SEM (SBF-SEM) ein Ultramikrotom im REM, um Material von der Blockfläche vor der Bildgebung zu entfernen 11,12, während die Array-Tomographie ein zerstörungsfreier Prozess ist, der die Sammlung von seriellen Abschnitten auf Deckgläsern, Wafern oder Bändern erfordert, bevor ein automatisierter Workflow der Bildgebung des interessierenden Bereichs in sequenziellen Abschnitten im REM eingerichtet wird, um den ^{3D-Datensatz zu generieren 13} . Ähnlich wie bei der Array-Tomographie erfordert die serielle Schnitt-TEM (ssTEM), dass vor der Bildgebung physikalische Schnitte gesammelt werden. Diese Abschnitte werden jedoch in TEM-Rastern gesammelt und in einem TEM^14,15,16 abgebildet. ssTEM kann durch Tilttomographie^17,18,19 erweitert werden. Die serielle Neigungstomographie bietet die beste Auflösung in x, y und z, und obwohl sie zur Rekonstruktion ganzer Zellen²⁰ verwendet wurde, ist sie eine ziemliche Herausforderung. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die praktischen Aspekte von ssTEM als der am besten zugänglichen vEM-Technik, die vielen EM-Labors zur Verfügung steht, die derzeit möglicherweise keinen Zugang zu spezialisierten Schnitt- oder vEM-Instrumenten haben, aber von der Generierung von 3D-vEM-Daten profitieren würden.

Die serielle Ultramikrotomie für die 3D-Rekonstruktion wurde bisher als Herausforderung angesehen. Es war schwierig, gerade Bänder mit gleichmäßiger Schnittstärke zu schneiden, in der Lage zu sein, Bänder der richtigen Größe in der richtigen Reihenfolge auf Gittern mit ausreichender Unterstützung anzuordnen und aufzunehmen, aber ohne Gitterbalken, die Bereiche von Interesse verdeckten, und vor allem, ohne Abschnitte zu verlieren, da eine unvollständige Serie eine vollständige 3D-Rekonstruktion verhindern kann²¹. Verbesserungen an kommerziellen Ultramikrotomen, Diamantschneid- und Trimmmessern ^22,23, elektronenluzenten Stützfolien auf Gittern 21,24 und Klebstoffen zur Unterstützung der Schnitthaftung und Bandkonservierung ^13,21 sind jedoch nur einige der inkrementellen Fortschritte im Laufe der Jahre, die die Technik in vielen Labors zur Routine gemacht haben. Sobald serielle Abschnitte gesammelt wurden, ist die serielle Bildgebung in TEM einfach und kann EM-Bilder mit Subnanometer-px-Größen in x und y liefern, was eine hochauflösende Abfrage der subzellulären Strukturen ermöglicht – eine potenzielle Anforderung für viele Forschungsfragen. Die hier vorgestellte Fallstudie zeigt die Verwendung von ssTEM und 3D-Rekonstruktion bei der Untersuchung von endoplasmatischen Retikulum (ER)-Organellenkontakten in Leberhepatozyten, wo ER-Organellen-Kontakte zuerst beobachtet wurden^25,26.

Während die Notaufnahme an die Kernhülle angrenzt, nimmt sie auch enge Kontakte zu zahlreichen anderen Zellorganellen auf, darunter Lysosomen, Mitochondrien, Lipidtröpfchen und die Plasmamembran²⁷. ER-Organellen-Kontakte wurden mit dem Fettstoffwechsel²⁸, dem Phosphoinositid- und Calcium-Signalsystem²⁹, der Autophagieregulation und der Stressreaktion^30,31 in Verbindung gebracht. Die ER-Organellenkontakte und andere interorganelle Kontakte sind hochdynamische Strukturen, die auf zelluläre Stoffwechselbedürfnisse und extrazelluläre Hinweise reagieren. Es wurde gezeigt, dass sie morphologisch in ihrer Größe und Form und den Abständen zwischen Organellenmembranen^{variieren 32,33}. Es wird angenommen, dass diese ultrastrukturellen Unterschiede wahrscheinlich ihre unterschiedliche Protein-Lipid-Zusammensetzung und Funktion^{widerspiegeln 34,35}. Es ist jedoch immer noch eine herausfordernde Aufgabe, interorganelle Kontakte zu definieren und zu analysieren³⁶. Daher ist ein zuverlässiges und dennoch einfaches Protokoll zur Untersuchung und Charakterisierung von interorganellen Kontakten für weitere Untersuchungen erforderlich.

Da ER-Organellenkontakte bei der Membran-zu-Membran-Trennung zwischen 10 und 30 nm liegen können, war der Goldstandard für die Identifizierung in der Vergangenheit TEM. Dünnschnittiges TEM hat eine spezifische Subdomänenlokalisation für residente ER-Proteine an verschiedenen Membrankontakten³⁷ aufgedeckt. Traditionell hat dies ER-Organellen-Kontakte mit nm-Auflösung aufgedeckt, aber oft nur eine 2D-Ansicht dieser Wechselwirkungen präsentiert. vEM-Ansätze zeigen jedoch die ultrastrukturelle Darstellung und den Kontext dieser Kontaktstellen in 3D, was eine vollständige Rekonstruktion von Kontakten und eine genauere Klassifizierung von Kontakten (Punkt vs. röhrenförmig vs. zisternalähnlich) und Quantifizierung^38,39 ermöglicht. Hepatozyten sind nicht nur der erste Zelltyp, bei dem ER-Organellenkontakte beobachtet wurden^25,26, sondern haben auch ein umfangreiches System anderer interorganeller Kontakte, die in ihrer Architektur und Physiologie eine wichtige Rolle spielen ^28,40. Eine gründliche morphologische Charakterisierung von ER-Organellen und anderen interorganellen Kontakten in Hepatozyten fehlt jedoch noch. Dementsprechend ist die Art und Weise, wie sich interorganelle Kontakte während der Regeneration und Reparatur bilden und umgestalten, von besonderer Relevanz für die Biologie und Leberfunktion der Hepatozyten.

Protocol

Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des britischen Innenministeriums untergebracht, und die Gewebeentnahme wurde in Übereinstimmung mit dem UK Animal (Scientific Procedures) Act 1986 durchgeführt. 1. Fixierung und Vorbereitung der Proben Sezieren Sie das Lebergewebe in Stücke von geeigneter Größe, etwa 8 mm x 8 mm x 3 mm, und legen Sie die Stücke in warme phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, 37 ° C). Injizieren Sie Raumtempe…

Representative Results

Für diese Technik werden interessante Regionen auf der Grundlage des biologischen Forschungsziels ausgewählt und vor dem Trimmen und Schneiden von eingebettetem Gewebe identifiziert. Ebenso kann die Größe der Blockfläche durch die Forschungsfrage diktiert werden; In diesem Fall wurde die Probe so beschnitten, dass eine Blockfläche von etwa 0,3 mm x 0,15 mm übrig blieb (Abbildung 4A). Dies ermöglichte zwei Gitter von 9 seriellen Abschnitten pro Gitter, die 18 serielle Abschnitte liefe…

Discussion

Eine zugängliche vEM-Technik zur Visualisierung der Organellenstruktur und -interaktionen in 3D wird in diesem Protokoll beschrieben. Die Morphologie der interorganellen Kontakte in Hepatozyten wird hier als Fallstudie vorgestellt. Dieser Ansatz wurde jedoch auch zur Untersuchung einer Vielzahl anderer Proben und Forschungsbereiche angewendet, darunter Schwann-Zell-Endothel-Interaktionen in peripheren Nerven 45, Weibel-Palade-Körper-Biogenese in Endothelzellen⁴⁶, Frachtsekretion in Nierenzellen …

Materials

0.22 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
Aluminum trays	Agar Scientific	AGG3912
Amira v6	ThermoFisher		https://www.thermofisher.com
Chloroform	Fisher	C/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride	TAAB	T027	Epon ingredient
Diamond knife	DiaTOME	ultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol	TAAB	D032	Epon ingredient
Dumont Tweezers N5	Agar Scientific	AGT5293
Fiji			https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 plugin			https://imagej.net/
Formaldehyde 36% solution	TAAB	F003
Formvar coated slot grid	Homemade		Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)
Glass bottle with applicator rod	Medisca	6258
Glass vials	Fisher Scientific	15364769
Gluteraldehyde 25% solution	TAAB	G011
MNA/Methyl Nadic Anhydride	TAAB	M011	Epon ingredient
Osmium Tetroxide 2% solution	TAAB	O005
Potassium Ferricyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene oxide	Fisher Scientific	E/0050/PB08
Reuseable adhesive	Blue Tack
Reynolds Lead Citrate	TAAB	L037	Section stain
Sodium Cacodylate	Sigma-Aldrich	C-0250	to make 0.1 M Caco buffer
Super Glue	RS Components	918-6872	Cyanoacrylate glue, Step 1.3
TAAB 812 Resin	TAAB	T023	Epon ingredient
Tannic acid	TAAB	T046
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Two part Epoxy Resin	RS Components	132-605	Alternative: Step 2.13
Ultramicrotome	Leica	UC7
Vibrating microtome	Leica		100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .
Weldwood Original Contact cement	DAP	107	Contact adhesive: Step 3.1.4