सीरियल सेक्शन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके हेपेटोसाइट्स में इंटरऑर्गेनेल संपर्क साइटों का त्रि-आयामी लक्षण वर्णन
Summary
यकृत या अन्य ऊतकों में कोशिकाओं से हेपेटोसाइट्स में ऑर्गेनेल के बीच झिल्ली संपर्क स्थलों के तीन आयामी विवरण प्राप्त करने के लिए एक सरल और व्यापक प्रोटोकॉल।
Abstract
संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी को लंबे समय से सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए सोने का मानक माना जाता है। हालांकि, विश्लेषण अक्सर दो आयामों तक सीमित होता है, जो ऑर्गेनेल के बीच तीन आयामी (3 डी) अल्ट्रास्ट्रक्चर और कार्यात्मक संबंधों का पूरी तरह से वर्णन करने की क्षमता को बाधित करता है। वॉल्यूम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (वीईएम) तकनीकों के एक संग्रह का वर्णन करता है जो मेसोस्केल, माइक्रोस्केल और नैनोस्केल रिज़ॉल्यूशन पर 3 डी में सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर की पूछताछ को सक्षम करता है।
यह प्रोटोकॉल सीरियल सेक्शन ट्रांसमिशन ईएम (टीईएम) का उपयोग करके वीईएम डेटा प्राप्त करने के लिए एक सुलभ और मजबूत विधि प्रदान करता है और एकल, सरल वर्कफ़्लो में डिजिटल 3 डी पुनर्निर्माण के माध्यम से नमूना प्रसंस्करण के तकनीकी पहलुओं को कवर करता है। इस तकनीक की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम और माइटोकॉन्ड्रिया और यकृत हेपेटोसाइट्स में उनके संपर्क स्थलों के बीच 3 डी अल्ट्रास्ट्रक्चरल संबंध प्रस्तुत किया गया है। इंटरऑर्गेनेल संपर्क ऑर्गेनेल के बीच आयनों, लिपिड, पोषक तत्वों और अन्य छोटे अणुओं के हस्तांतरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, हेपेटोसाइट्स में उनकी प्रारंभिक खोज के बावजूद, उनकी शारीरिक विशेषताओं, गतिशीलता और कार्यों के बारे में जानने के लिए अभी भी बहुत कुछ है।
इंटरऑर्गेनेल संपर्क आकारिकी की एक श्रृंखला प्रदर्शित कर सकते हैं, जो दो ऑर्गेनेल की निकटता में एक दूसरे (आमतौर पर ~ 10-30 एनएम) और संपर्क साइट की सीमा (बड़े 3 डी कुंडीय जैसे संपर्कों तक) में भिन्न होते हैं। करीबी संपर्कों की परीक्षा के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की आवश्यकता होती है, और सीरियल सेक्शन टीईएम हेपेटोसाइट भेदभाव के दौरान इंटरऑर्गेनेल संपर्कों के 3 डी अल्ट्रास्ट्रक्चरल की कल्पना करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, साथ ही चयापचय रोगों से जुड़े हेपेटोसाइट आर्किटेक्चर में परिवर्तन भी।
Introduction
1 9 30 के दशक में उनके आविष्कार के बाद से, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप ने शोधकर्ताओं को कोशिकाओं और ऊतकों के संरचनात्मक घटकों को 1,2 की कल्पना करने की अनुमति दी है। अधिकांश जांचों ने 2 डी जानकारी प्रदान की है, क्योंकि 3 डी मॉडल बनाने के लिए श्रमसाध्य सीरियल सेक्शन संग्रह, मैनुअल फोटोग्राफी, नकारात्मक प्रसंस्करण, मैनुअल ट्रेसिंग, और ग्लास, प्लास्टिक, या स्टायरोफोम 3,4 की चादरों से3 डी मॉडल के निर्माण और असेंबली की आवश्यकता होती है। लगभग 70 साल बाद, प्रक्रिया के कई पहलुओं में काफी प्रगति हुई है, माइक्रोस्कोप प्रदर्शन, सीरियल सेक्शन संग्रह, स्वचालित डिजिटल इमेजिंग, परिष्कृत सॉफ्टवेयर और हार्डवेयर से 3 डी पुनर्निर्माण के लिए, विज़ुअलाइज़ेशन, और विश्लेषण के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण जो अब सामूहिक रूप से वॉल्यूम ईएम (वीईएम) कहा जाता है। इन वीईएम तकनीकों को आम तौर पर माइक्रोन तराजू में नैनोमीटर रिज़ॉल्यूशन पर 3 डी अल्ट्रास्ट्रक्चरल जानकारी प्रदान करने के लिए माना जाता है और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) और नई स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) तकनीकों को शामिल किया जाता है; समीक्षाएँ देखें 5,6,7,8.
उदाहरण के लिए, केंद्रित आयन बीम SEM (FIB-SEM) ब्लॉक की सतह के अनुक्रमिक SEM इमेजिंग स्कैन के बीच ब्लॉक की सतह को दूर करने के लिए एक SEM के अंदर एक केंद्रित आयन बीम का उपयोग करता है, जिससे एक नमूने के दोहराए गए स्वचालित मिलिंग / इमेजिंग की अनुमति मिलती है और पुनर्निर्माण 9,10 के लिए 3 डी डेटासेट का निर्माण होता है। इसके विपरीत, सीरियल ब्लॉक फेस एसईएम (एसबीएफ-एसईएम)इमेजिंग 11,12 से पहले ब्लॉक फेस से सामग्री को हटाने के लिए एसईएम के अंदर एक अल्ट्रामाइक्रोबियल का उपयोग करता है, जबकि सरणी टोमोग्राफी एक गैर-विनाशकारी प्रक्रिया है जिसके लिए सीरियल सेक्शन के संग्रह की आवश्यकता होती है, कवरस्लिप्स, वेफर्स, या टेप पर, 3 डी डेटासेट13 उत्पन्न करने के लिए एसईएम में अनुक्रमिक वर्गों में रुचि के क्षेत्र को इमेजिंग करने के एक स्वचालित वर्कफ़्लो की स्थापना करने से पहले। . सरणी टोमोग्राफी के समान, सीरियल सेक्शन टीईएम (एसएसटीईएम) को इमेजिंग से पहले एकत्र किए जाने के लिए भौतिक वर्गों की आवश्यकता होती है; हालांकि, इन वर्गों को TEM ग्रिड पर एकत्र किया जाता है और TEM14,15,16 में चित्रित किया जाता है। ssTEM17,18,19 झुकाव टोमोग्राफी प्रदर्शन करके बढ़ाया जा सकता है. सीरियल टिल्ट टोमोग्राफी एक्स, वाई और जेड में सबसे अच्छा रिज़ॉल्यूशन प्रदान करती है, और जब इसका उपयोग पूरे कोशिकाओं20 के पुनर्निर्माण के लिए किया गया है, तो यह यथोचित रूप से चुनौतीपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल एसएसटीईएम के व्यावहारिक पहलुओं पर केंद्रित है क्योंकि कई ईएम प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध सबसे सुलभ वीईएम तकनीक है, जिनके पास वर्तमान में विशेष सेक्शनिंग या वीईएम उपकरणों तक पहुंच नहीं हो सकती है, लेकिन 3 डी वीईएम डेटा उत्पन्न करने से लाभ होगा।
3 डी पुनर्निर्माण के लिए सीरियल अल्ट्रामाइक्रोटॉमी को पहले चुनौतीपूर्ण माना जाता है। यहां तक कि अनुभाग मोटाई के सीधे रिबन को काटना मुश्किल था, सही आकार के रिबन को व्यवस्थित करने और लेने में सक्षम होना, सही क्रम में, पर्याप्त समर्थन के साथ ग्रिड पर, लेकिन ग्रिड सलाखों के बिना ब्याज के क्षेत्रों को अस्पष्ट करना, और सबसे महत्वपूर्ण बात, वर्गों को खोने के बिना, क्योंकि एक अधूरी श्रृंखला पूर्ण 3 डी पुनर्निर्माण21 को रोक सकती है। हालांकि, वाणिज्यिक ultramicrotomes, हीरे काटने और ट्रिमिंग चाकू22,23, ग्रिड 21,24 पर इलेक्ट्रॉन lucent समर्थन फिल्मों के लिए सुधार, और अनुभाग आसंजन और रिबन संरक्षण13,21 की सहायता के लिए चिपकने वाला सिर्फ कुछ वृद्धिशील अग्रिमों है कि कई प्रयोगशालाओं में तकनीक और अधिक नियमित बना दिया है में से कुछ हैं. एक बार धारावाहिक वर्गों को एकत्र किए जाने के बाद, टीईएम में सीरियल इमेजिंग सीधा है और एक्स और वाई में सबनैनोमीटर पीएक्स आकार के साथ ईएम छवियां प्रदान कर सकता है, जिससे उपकोशिकीय संरचनाओं की उच्च-रिज़ॉल्यूशन पूछताछ की अनुमति मिलती है- कई शोध प्रश्नों के लिए एक संभावित आवश्यकता। यहां प्रस्तुत केस स्टडी यकृत हेपेटोसाइट्स में एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) -ऑर्गेनेल संपर्कों के अध्ययन में एसएसटीईएम और 3 डी पुनर्निर्माण के उपयोग को दर्शाता है, जहां ईआर-ऑर्गेनेल संपर्कों को पहली बार25,26 देखा गया था।
परमाणु लिफाफे के साथ सन्निहित होने के दौरान, ईआर लाइसोसोम, माइटोकॉन्ड्रिया, लिपिड बूंदों और प्लाज्मा झिल्ली27 सहित कई अन्य सेल ऑर्गेनेल के साथ घनिष्ठ संपर्क भी बनाता है। ईआर-ऑर्गेनेल संपर्कों को लिपिड चयापचय28, फॉस्फोइनोसिटाइड और कैल्शियम सिग्नलिंग29, ऑटोफैगी विनियमन और तनाव प्रतिक्रिया30,31 में फंसाया गया है। ईआर-ऑर्गेनेल संपर्क और अन्य इंटरऑर्गेनेल संपर्क अत्यधिक गतिशील संरचनाएं हैं जो सेलुलर चयापचय की जरूरतों और बाहरी संकेतों का जवाब देती हैं। उन्हें उनके आकार और आकार और ऑर्गेनेल झिल्ली के बीच की दूरी में रूपात्मक रूप से भिन्न दिखाया गया है32,33। यह माना जाता है कि ये अल्ट्रास्ट्रक्चरल अंतर उनके विभिन्न प्रोटीन / लिपिड रचनाओं और कार्य34,35 को प्रतिबिंबित करने की संभावना रखते हैं। हालांकि, इंटरऑर्गेनेल संपर्कों को परिभाषित करना और उनका विश्लेषण करना अभी भी एक चुनौतीपूर्ण कार्यहै। इसलिए, आगे की जांच के लिए इंटरऑर्गेनेल संपर्कों की जांच और विशेषता के लिए एक विश्वसनीय अभी तक सरल प्रोटोकॉल की आवश्यकता है।
चूंकि ईआर-ऑर्गेनेल संपर्क झिल्ली-से-झिल्ली अलगाव में 10 से 30 एनएम तक हो सकते हैं, इसलिए पहचान के लिए सोने का मानक ऐतिहासिक रूप से टीईएम रहा है। थिन-सेक्शन टीईएम ने अलग-अलग झिल्ली संपर्कों37 पर निवासी ईआर प्रोटीन के लिए विशिष्ट उपडोमेन स्थानीयकरण का खुलासा किया है। परंपरागत रूप से, इसने एनएम रिज़ॉल्यूशन के साथ ईआर-ऑर्गेनेल संपर्कों का खुलासा किया है, लेकिन अक्सर इन इंटरैक्शन का केवल 2 डी दृश्य प्रस्तुत किया जाता है। हालांकि, वीईएम दृष्टिकोण 3 डी में इन संपर्क साइटों की अल्ट्रास्ट्रक्चरल प्रस्तुति और संदर्भ को प्रकट करते हैं, जिससे संपर्कों का पूर्ण पुनर्निर्माण और संपर्कों का अधिक सटीक वर्गीकरण (बिंदु बनाम ट्यूबलर बनाम टंकी की तरह) और परिमाणीकरण38,39 हो जाता है। पहला सेल प्रकार होने के अलावा जहां ईआर-ऑर्गेनेलसंपर्कों को 25,26 देखा गया था, हेपेटोसाइट्स में अन्य इंटरऑर्गेनेल संपर्कों की एक व्यापक प्रणाली होती है जो उनकी वास्तुकला और शरीर विज्ञान28,40 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। हालांकि, हेपेटोसाइट्स में ईआर-ऑर्गेनेल और अन्य इंटरऑर्गेनेल संपर्कों के पूरी तरह से रूपात्मक लक्षण वर्णन में अभी भी कमी है। तदनुसार, पुनर्जनन और मरम्मत के दौरान इंटरऑर्गेनेल संपर्क कैसे बनते हैं और फिर से तैयार होते हैं, हेपेटोसाइट जीव विज्ञान और यकृत समारोह के लिए विशेष प्रासंगिकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
3 डी में ऑर्गेनेल संरचना और इंटरैक्शन की कल्पना करने के लिए एक सुलभ वीईएम तकनीक का वर्णन इस प्रोटोकॉल में किया गया है। हेपेटोसाइट्स में इंटरऑर्गेनेल संपर्कों की आकृति विज्ञान को यहां एक मामले के अध्यय…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जोआना Hanley, रेबेका Fiadeiro, और विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए Ania Straatman-Iwanowska धन्यवाद. हम स्टीफन प्रयोगशाला के सदस्यों और इयान जे व्हाइट को उपयोगी चर्चाओं के लिए भी धन्यवाद देते हैं। जे.जे. .B यूसीएल में आणविक सेल जीव विज्ञान की एमआरसी प्रयोगशाला को एमआरसी फंडिंग द्वारा समर्थित है, पुरस्कार कोड MC_U12266B। सी.जे.एस. यूसीएल में आणविक सेल जीव विज्ञान विश्वविद्यालय इकाई की एमआरसी प्रयोगशाला को एमआरसी वित्त पोषण द्वारा समर्थित है, पुरस्कार कोड MC_UU_00012/ P.G. यूरोपीय अनुसंधान परिषद, अनुदान कोड ERC-2013-StG-337057 द्वारा वित्त पोषित है।
Materials
| 0.22 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Aluminum trays | Agar Scientific | AGG3912 | |
| Amira v6 | ThermoFisher | https://www.thermofisher.com | |
| Chloroform | Fisher | C/4960/PB08 | |
| DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride | TAAB | T027 | Epon ingredient |
| Diamond knife | DiaTOME | ultra 45° | |
| DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol | TAAB | D032 | Epon ingredient |
| Dumont Tweezers N5 | Agar Scientific | AGT5293 | |
| Fiji | https://imagej.net/ | ||
| Fiji TrakEM2 plugin | https://imagej.net/ | ||
| Formaldehyde 36% solution | TAAB | F003 | |
| Formvar coated slot grid | Homemade | Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu) | |
| Glass bottle with applicator rod | Medisca | 6258 | |
| Glass vials | Fisher Scientific | 15364769 | |
| Gluteraldehyde 25% solution | TAAB | G011 | |
| MNA/Methyl Nadic Anhydride | TAAB | M011 | Epon ingredient |
| Osmium Tetroxide 2% solution | TAAB | O005 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma-Aldrich | P-8131 | |
| Propylene oxide | Fisher Scientific | E/0050/PB08 | |
| Reuseable adhesive | Blue Tack | ||
| Reynolds Lead Citrate | TAAB | L037 | Section stain |
| Sodium Cacodylate | Sigma-Aldrich | C-0250 | to make 0.1 M Caco buffer |
| Super Glue | RS Components | 918-6872 | Cyanoacrylate glue, Step 1.3 |
| TAAB 812 Resin | TAAB | T023 | Epon ingredient |
| Tannic acid | TAAB | T046 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Two part Epoxy Resin | RS Components | 132-605 | Alternative: Step 2.13 |
| Ultramicrotome | Leica | UC7 | |
| Vibrating microtome | Leica | 100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude . | |
| Weldwood Original Contact cement | DAP | 107 | Contact adhesive: Step 3.1.4 |
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