Caratterizzazione tridimensionale dei siti di contatto interorganelle negli epatociti mediante microscopia elettronica a sezione seriale

Summary

Un protocollo semplice e completo per acquisire dettagli tridimensionali dei siti di contatto della membrana tra organelli negli epatociti dal fegato o cellule in altri tessuti.

Abstract

La microscopia elettronica a trasmissione è stata a lungo considerata il gold standard per la visualizzazione dell’ultrastruttura cellulare. Tuttavia, l’analisi è spesso limitata a due dimensioni, ostacolando la capacità di descrivere completamente l’ultrastruttura tridimensionale (3D) e la relazione funzionale tra gli organelli. La microscopia elettronica volumetrica (vEM) descrive una raccolta di tecniche che consentono l’interrogazione dell’ultrastruttura cellulare in 3D a mesoscala, microscala e risoluzioni su scala nanometrica.

Questo protocollo fornisce un metodo accessibile e robusto per acquisire dati vEM utilizzando la trasmissione a sezione seriale EM (TEM) e copre gli aspetti tecnici dell’elaborazione dei campioni fino alla ricostruzione 3D digitale in un unico flusso di lavoro semplice. Per dimostrare l’utilità di questa tecnica, viene presentata la relazione ultrastrutturale 3D tra il reticolo endoplasmatico e i mitocondri e i loro siti di contatto negli epatociti epatici. I contatti interorganelle svolgono ruoli vitali nel trasferimento di ioni, lipidi, sostanze nutritive e altre piccole molecole tra gli organelli. Tuttavia, nonostante la loro scoperta iniziale negli epatociti, c’è ancora molto da imparare sulle loro caratteristiche fisiche, dinamiche e funzioni.

I contatti interorganelle possono mostrare una gamma di morfologie, che variano nella vicinanza dei due organelli l’uno all’altro (in genere ~ 10-30 nm) e l’estensione del sito di contatto (dai contatti puntati ai contatti 3D più grandi simili a cisternali). L’esame dei contatti stretti richiede l’imaging ad alta risoluzione e la sezione seriale TEM è adatta per visualizzare l’ultrastrutturale 3D dei contatti interorganelle durante la differenziazione degli epatociti, nonché le alterazioni dell’architettura degli epatociti associate a malattie metaboliche.

Introduction

Dalla loro invenzione nel 1930, i microscopi elettronici hanno permesso ai ricercatori di visualizzare i componenti strutturali di cellule e tessuti ^1,2. La maggior parte delle indagini ha fornito informazioni 2D, poiché la costruzione di modelli 3D richiede una scrupolosa raccolta di sezioni seriali, fotografia manuale, elaborazione negativa, tracciamento manuale e la creazione e l’assemblaggio di modelli 3D da lastre di vetro, plastica o polistirolo ^3,4. Quasi 70 anni dopo, ci sono stati notevoli progressi in numerosi aspetti del processo, dalle prestazioni del microscopio, alla raccolta di sezioni seriali, all’imaging digitale automatizzato, al sofisticato software e hardware per la ricostruzione, la visualizzazione e l’analisi 3D ad approcci alternativi per quello che ora è collettivamente chiamato volume EM (vEM). Queste tecniche vEM sono generalmente considerate per fornire informazioni ultrastrutturali 3D a risoluzioni nanometriche su scale micron e comprendono la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e le più recenti tecniche di microscopia elettronica a scansione (SEM); vedi recensioni 5,6,7,8.

Ad esempio, il fascio ionico focalizzato SEM (FIB-SEM) utilizza un fascio ionico focalizzato all’interno di un SEM per fresare la superficie del blocco tra scansioni sequenziali seM della superficie del blocco, consentendo la fresatura / imaging automatizzato ripetuto di un campione e la creazione di un set di dati 3D per la ricostruzione ^9,10. Al contrario, il blocco seriale FACCIA SEM (SBF-SEM) utilizza un ultramicrotomo all’interno del SEM per rimuovere materiale dalla faccia del blocco prima dell’imaging ^11,12, mentre la tomografia array è un processo non distruttivo che richiede la raccolta di sezioni seriali, su coverslip, wafer o nastro, prima di impostare un flusso di lavoro automatizzato di imaging della regione di interesse nelle sezioni sequenziali nel SEM per generare il set di dati 3D¹³ . Simile alla tomografia ad array, la sezione seriale TEM (ssTEM) richiede che le sezioni fisiche siano raccolte prima dell’imaging; tuttavia, queste sezioni sono raccolte su griglie TEM e fotografate in un TEM 14,15,16. ssTEM può essere esteso eseguendo la tomografia tilt 17,18,19. La tomografia inclinabile seriale fornisce la migliore risoluzione in x, y e z e, sebbene sia stata utilizzata per ricostruire intere celle²⁰, è ragionevolmente impegnativa. Questo protocollo si concentra sugli aspetti pratici di ssTEM come la tecnica vEM più accessibile disponibile per molti laboratori EM che potrebbero non avere attualmente accesso a strumenti specializzati di sezionamento o vEM, ma trarrebbero vantaggio dalla generazione di dati vEM 3D.

L’ultramicrotomia seriale per la ricostruzione 3D è stata precedentemente considerata impegnativa. Era difficile tagliare nastri dritti di spessore di sezione uniforme, essere in grado di disporre e raccogliere nastri delle dimensioni corrette, nell’ordine corretto, su griglie con supporto sufficiente, ma senza barre della griglia che oscuravano le regioni di interesse e, soprattutto, senza perdere sezioni, poiché una serie incompleta potrebbe impedire la ricostruzione 3D completa²¹. Tuttavia, i miglioramenti agli ultramicrotomi commerciali, i coltelli da taglio e rifilatura diamantati ^22,23, le pellicole di supporto elettrone lucente sulle griglie ^21,24 e gli adesivi per aiutare l’adesione della sezione e la conservazione del nastro^13,21 sono solo alcuni dei progressi incrementali nel corso degli anni che hanno reso la tecnica più di routine in molti laboratori. Una volta raccolte le sezioni seriali, l’imaging seriale in TEM è semplice e può fornire immagini EM con dimensioni px subnanometriche in x e y, consentendo l’interrogazione ad alta risoluzione delle strutture subcellulari, un potenziale requisito per molte domande di ricerca. Il caso di studio qui presentato dimostra l’uso di ssTEM e ricostruzione 3D nello studio dei contatti reticolo endoplasmatico (ER)-organello negli epatociti epatici, dove i contatti ER-organello sono stati osservati per la prima volta^25,26.

Pur essendo contiguo con l’involucro nucleare, l’ER ha anche stretti contatti con numerosi altri organelli cellulari, tra cui lisosomi, mitocondri, goccioline lipidiche e la membrana plasmatica²⁷. I contatti ER-organello sono stati implicati nel metabolismo lipidico²⁸, nella segnalazione fosfoinositide e calcio²⁹, nella regolazione dell’autofagia e nella risposta allo stress^30,31. I contatti ER-organello e altri contatti interorganelle sono strutture altamente dinamiche che rispondono alle esigenze metaboliche cellulari e ai segnali extracellulari. È stato dimostrato che variano morfologicamente nelle loro dimensioni e forma e nelle distanze tra le membrane degli organelli^32,33. Si ritiene che queste differenze ultrastrutturali riflettano probabilmente le loro diverse composizioni proteiche / lipidiche e la funzione^34,35. Tuttavia, è ancora un compito impegnativo definire i contatti interorganelle e analizzarli³⁶. Pertanto, è necessario un protocollo affidabile ma semplice per esaminare e caratterizzare i contatti interorganelle per ulteriori indagini.

Poiché i contatti ER-organello possono variare da 10 a 30 nm nella separazione membrana-membrana, il gold standard per l’identificazione è stato storicamente TEM. Il TEM a sezione sottile ha rivelato la localizzazione di sottodomini specifici per le proteine ER residenti a contatti di membrana distinti³⁷. Tradizionalmente, questo ha rivelato contatti ER-organello con risoluzione nm, ma spesso ha presentato solo una visione 2D di queste interazioni. Tuttavia, gli approcci vEM rivelano la presentazione ultrastrutturale e il contesto di questi siti di contatto in 3D, consentendo la ricostruzione completa dei contatti e una classificazione più accurata dei contatti (punto vs. tubolare vs. simile a cisternale) e la quantificazione^38,39. Oltre ad essere il primo tipo di cellula in cui sono stati osservati contatti ER-organello^25,26, gli epatociti hanno un ampio sistema di altri contatti interorganelli che svolgono ruoli vitali nella loro architettura e fisiologia^28,40. Tuttavia, manca ancora un’accurata caratterizzazione morfologica dell’ER-organello e di altri contatti interorganelli negli epatociti. Di conseguenza, il modo in cui i contatti interorganelle si formano e rimodellano durante la rigenerazione e la riparazione è di particolare rilevanza per la biologia degli epatociti e la funzionalità epatica.

Protocol

Tutti gli animali sono stati alloggiati in conformità con le linee guida del Ministero degli Interni del Regno Unito e la raccolta dei tessuti è stata effettuata in conformità con l’Animal (Scientific Procedures) Act del Regno Unito del 1986. 1. Fissazione e preparazione del campione Sezionare il tessuto epatico in pezzi di dimensioni appropriate, circa 8 mm x 8 mm x 3 mm, e posizionare i pezzi in soluzione salina calda tamponata con fosfato (PBS, 37 °C). <…

Representative Results

Per questa tecnica, le regioni di interesse vengono selezionate in base all’obiettivo della ricerca biologica e identificate prima del taglio e del sezionamento del tessuto incorporato. Allo stesso modo, la dimensione della faccia del blocco può essere dettata dalla domanda di ricerca; in questo caso, il campione è stato tagliato per lasciare una faccia di blocco di circa 0,3 mm x 0,15 mm (Figura 4A). Ciò ha permesso di creare due griglie di 9 sezioni seriali per griglia, fornendo 18 sezi…

Discussion

In questo protocollo è descritta una tecnica vEM accessibile per visualizzare la struttura e le interazioni degli organelli in 3D. La morfologia dei contatti interorganelle negli epatociti è presentata come un caso di studio qui. Tuttavia, questo approccio è stato applicato anche per studiare una varietà di altri campioni e aree di ricerca, tra cui le interazioni cellula-endotelio di Schwann nei nervi periferici⁴⁵, la biogenesi del corpo di Weibel Palade nelle cellule endoteliali<sup class="xr…

Materials

0.22 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
Aluminum trays	Agar Scientific	AGG3912
Amira v6	ThermoFisher		https://www.thermofisher.com
Chloroform	Fisher	C/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride	TAAB	T027	Epon ingredient
Diamond knife	DiaTOME	ultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol	TAAB	D032	Epon ingredient
Dumont Tweezers N5	Agar Scientific	AGT5293
Fiji			https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 plugin			https://imagej.net/
Formaldehyde 36% solution	TAAB	F003
Formvar coated slot grid	Homemade		Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)
Glass bottle with applicator rod	Medisca	6258
Glass vials	Fisher Scientific	15364769
Gluteraldehyde 25% solution	TAAB	G011
MNA/Methyl Nadic Anhydride	TAAB	M011	Epon ingredient
Osmium Tetroxide 2% solution	TAAB	O005
Potassium Ferricyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene oxide	Fisher Scientific	E/0050/PB08
Reuseable adhesive	Blue Tack
Reynolds Lead Citrate	TAAB	L037	Section stain
Sodium Cacodylate	Sigma-Aldrich	C-0250	to make 0.1 M Caco buffer
Super Glue	RS Components	918-6872	Cyanoacrylate glue, Step 1.3
TAAB 812 Resin	TAAB	T023	Epon ingredient
Tannic acid	TAAB	T046
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Two part Epoxy Resin	RS Components	132-605	Alternative: Step 2.13
Ultramicrotome	Leica	UC7
Vibrating microtome	Leica		100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .
Weldwood Original Contact cement	DAP	107	Contact adhesive: Step 3.1.4