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Biologia

직렬 섹션 전자 현미경을 사용하여 간세포에서 소기관 간 접촉 부위의 입체 특성화

Published: June 09, 2022
doi:
10.3791/63496
, , ,
1MRC Laboratory for Molecular Cell Biology,University College London, 2NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre,University College London

Summary

간세포의 소기관 또는 다른 조직의 세포 사이의 막 접촉 부위의 입체 세부 사항을 획득하는 간단하고 포괄적 인 프로토콜.

Abstract

투과 전자 현미경 검사는 오랫동안 세포 초 구조의 시각화를위한 황금 표준으로 간주되어 왔습니다. 그러나 분석은 종종 두 차원으로 제한되어 3차원(3D) 초구조와 소기관 간의 기능적 관계를 완전히 설명하는 능력을 방해합니다. 부피 전자 현미경 (vEM)은 메조 스케일, 마이크로 스케일 및 나노 스케일 해상도에서 3D로 세포 초 구조의 심문을 가능하게하는 기술 모음을 설명합니다.

이 프로토콜은 TEM(직렬 섹션 전송 EM)을 사용하여 vEM 데이터를 획득할 수 있는 액세스 가능하고 강력한 방법을 제공하며 샘플 처리부터 디지털 3D 재구성에 이르는 기술적 측면을 하나의 간단한 워크플로우에서 다룹니다. 이 기술의 유용성을 입증하기 위해, 소포체와 미토콘드리아와 간 간세포에서의 접촉 부위 사이의 3D 초구조적 관계가 제시된다. 소기관 간 접촉은 소기관 사이의 이온, 지질, 영양소 및 기타 소분자의 전달에 중요한 역할을합니다. 그러나 간세포에서의 초기 발견에도 불구하고 물리적 특징, 역학 및 기능에 대해 배울 것이 여전히 많습니다.

소기관 간 접촉은 두 소기관의 서로 근접성 (일반적으로 ~ 10-30nm)과 접촉 부위의 범위 (펑크 접촉에서 더 큰 3D cisternal-like 접촉에 이르기까지)에 따라 다양한 형태를 표시 할 수 있습니다. 밀접한 접촉을 검사하려면 고해상도 이미징이 필요하며 직렬 섹션 TEM은 간세포 분화 중 소기관 간 접촉의 3D 초구조뿐만 아니라 대사성 질환과 관련된 간세포 구조의 변화를 시각화하는 데 매우 적합합니다.

Introduction

1930 년대에 발명 된 이래로 전자 현미경을 통해 연구자들은 세포와 조직의 구조적 구성 요소 1,2를 시각화 할 수있었습니다. 대부분의 조사는 3D 모델을 구축하기 위해 힘든 직렬 섹션 수집, 수동 사진, 네거티브 처리, 수동 추적 및 유리, 플라스틱 또는 스티로폼 3,4 시트에서 3D 모델의 생성 및 조립이 필요하기 때문에 2D 정보를 제공했습니다. 거의 70년이 지난 지금, 현미경 성능, 직렬 섹션 수집, 자동화된 디지털 이미징, 3D 재구성, 시각화 및 분석을 위한 정교한 소프트웨어 및 하드웨어에서부터 현재 총칭되는 볼륨 EM(vEM)에 대한 대안적인 접근법에 이르기까지 프로세스의 다양한 측면에서 상당한 발전이 있었습니다. 이러한 vEM 기술은 일반적으로 미크론 스케일에 걸쳐 나노미터 해상도에서 3D 초구조 정보를 제공하는 것으로 간주되며 투과 전자 현미경 (TEM) 및 새로운 주사 전자 현미경 (SEM) 기술을 포함합니다. 리뷰 5,6,7,8 참조.

예를 들어, 집속 이온 빔 SEM (FIB-SEM)은 SEM 내부에 집중된 이온 빔을 사용하여 블록 표면의 순차적 SEM 이미징 스캔 사이에서 블록 표면을 밀링하여 샘플의 반복적인 자동 밀링 / 이미징을 허용하고재구성 9,10을위한 3D 데이터 세트를 구축 할 수 있습니다. 대조적으로, 직렬 블록 페이스 SEM(SBF-SEM)은 이미징(11,12) 이전에 블록 페이스로부터 재료를 제거하기 위해 SEM 내부의 초미세톰을 사용하는 반면, 어레이 단층 촬영은 3D 데이터 세트(13)를 생성하기 위해 SEM의 순차적 섹션에 관심 영역을 이미징하는 자동화된 워크플로우를 설정하기 전에 커버슬립, 웨이퍼 또는 테이프 상으로 직렬 섹션을 수집해야 하는 비파괴 프로세스이다. . 어레이 단층 촬영과 마찬가지로 직렬 섹션 TEM (ssTEM)은 이미징 전에 물리적 섹션을 수집해야합니다. 그러나 이러한 섹션은 TEM 그리드에서 수집되고 TEM14,15,16으로 이미지화됩니다. ssTEM은 틸트 단층 촬영17,18,19를 수행함으로써 확장될 수 있다. 직렬 틸트 단층 촬영은 x, y 및 z에서 최상의 해상도를 제공하며, 전체 셀(20)을 재구성하는 데 사용되었지만, 이는 합리적으로 도전적이다. 이 프로토콜은 현재 특수 단면화 또는 vEM 계측기에 액세스할 수 없지만 3D vEM 데이터 생성의 이점을 누릴 수 있는 많은 EM 실험실에서 사용할 수 있는 가장 접근하기 쉬운 vEM 기술로서 ssTEM의 실용적인 측면에 초점을 맞춥니다.

3D 재구성을위한 직렬 초미세 절제술은 이전에 도전적인 것으로 간주되었습니다. 짝수 단면 두께의 직선 리본을 절단하는 것이 어려웠고, 정확한 순서로, 정확한 크기의 리본을 충분한 지지를 받는 격자 상에 배열하고 픽업할 수 있어야 했지만, 관심 영역을 가리는 격자 막대가 없고, 가장 중요한 것은, 단면을 잃지 않고, 불완전한 시리즈가 완전한 3D 재구성(21)을 방지할 수 있기 때문이다. 그러나 상업용 초미세 토메, 다이아몬드 절단 및 트리밍 나이프 22,23, 그리드21,24의 전자 광택 지지 필름, 섹션 접착 및 리본 보존 보조 접착제 13,21에 대한 개선은 수년 동안 많은 실험실에서 기술을 더욱 일상적으로 만든 점진적 발전 중 일부에 지나지 않습니다. 직렬 섹션이 수집되면 TEM의 직렬 이미징이 간단하며 x 및 y의 서브나노미터 px 크기의 EM 이미지를 제공할 수 있으므로 많은 연구 질문에 대한 잠재적 요구 사항인 하위 세포 구조의 고해상도 심문이 가능합니다. 여기에 제시된 사례 연구는 ER – 소기관 접촉이 처음 관찰 된 간 간세포에서 소포체 (ER) – 소기관 접촉 연구에서 ssTEM 및 3D 재구성의 사용을 보여줍니다25,26.

핵 외피와 인접하는 동안, ER은 또한 리소좀, 미토콘드리아, 지질 방울, 및 원형질막(27)을 포함하는 수많은 다른 세포 소기관과 밀접한 접촉을 한다. ER-소기관 접촉은 지질 대사28, 포스포이노시타이드 및 칼슘 신호전달(29), 자가포식 조절, 및 스트레스 반응30,31에 연루되어 있다. ER-소기관 접촉 및 기타 소기관 간 접촉은 세포 대사 요구와 세포외 단서에 반응하는 매우 역동적인 구조이다. 그들은 크기와 모양, 그리고 소기관막 사이의 거리(32,33)에서 형태학적으로 변하는 것으로 나타났다. 이러한 초구조적 차이는 그들의 상이한 단백질/지질 조성 및 기능(34,35)을 반영할 가능성이 높다고 생각된다. 그러나, 소기관 간 접촉을 정의하고 이들을 분석하는 것은 여전히 어려운 과제이다(36). 따라서 추가 조사를 위해 소기관 간 접촉을 검사하고 특성화하기위한 신뢰할 수 있지만 간단한 프로토콜이 필요합니다.

ER-소기관 접촉은 멤브레인 대 멤브레인 분리에서 10 내지 30 nm의 범위를 가질 수 있기 때문에, 식별을 위한 황금 표준은 역사적으로 TEM이었다. 얇은 절편 TEM은 별개의 막 접촉부(37)에서 상주 ER 단백질에 대한 특이적 하위도메인 국재화를 밝혀냈다. 전통적으로 이것은 nm 분해능을 가진 ER – 소기관 접촉을 밝혀 냈지만 종종 이러한 상호 작용에 대한 2D 뷰 만 제시했습니다. 그러나 vEM 접근법은 이러한 접촉 부위의 초구조적 표현 및 컨텍스트를 3D로 밝혀 접점을 완전히 재구성하고 접점의 더 정확한 분류 (점 대 관형 대 수흉골 유사) 및 정량화38,39를 가능하게합니다. ER-소기관 접촉이 관찰된 최초의 세포 유형인 것 외에도(25,26), 간세포는 그들의 건축과 생리학 28,40에서 중요한 역할을 하는 다른 소기관 간 접촉의 광범위한 시스템을 가지고 있다. 그러나, 간세포에서의 ER-소기관 및 다른 소기관 간 접촉의 철저한 형태학적 특성화는 여전히 부족하다. 따라서, 재생 및 복구 동안 소기관 간 접촉이 형성되고 리모델링되는 방식은 간세포 생물학 및 간 기능과 특히 관련이 있습니다.

Protocol

모든 동물은 영국 내무부 지침에 따라 수용되었으며, 조직 수확은 영국 동물 (과학 절차) 법 1986에 따라 수행되었습니다. 1. 시편 고정 및 준비 간 조직을 적절한 크기의 조각, 대략 8 mm x 8 mm x 3 mm로 해부하고, 그 조각을 따뜻한 인산염 완충 식염수 (PBS, 37°C)에 넣는다. 실온 (20-25 °C) 고정제 (1 % 수크로오스 중 1.5 % 글루타르 알데히드, 0.1 M 카코 딜 레이…

Representative Results

이 기술의 경우, 관심 영역은 생물학적 연구 목표에 따라 선택되고 포매된 조직의 트리밍 및 절편화 전에 확인된다. 유사하게, 블록 얼굴의 크기는 연구 질문에 의해 결정될 수 있다; 이 경우, 샘플은 대략 0.3 mm x 0.15 mm의 블록 면을 남기도록 트리밍되었다(도 4A). 이를 통해 그리드 당 9 개의 직렬 섹션으로 구성된 두 개의 그리드를 허용하여 18 개의 직렬 섹션을 제공하고 약 62 …

Discussion

소기관 구조 및 상호작용을 3D로 시각화하기 위한 접근 가능한 vEM 기술이 이 프로토콜에 설명되어 있습니다. 간세포에서 소기관 간 접촉의 형태학은 여기에서 사례 연구로 제시됩니다. 그러나, 이러한 접근법은 또한 말초 신경에서의 슈완 세포-내피 상호작용(45), 내피 세포에서의 바이벨 팔레이드 바디 생물발생(46), 신장 세포에서의 화물 분비(47), 및 해마 뉴런<…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

전문적인 기술 지원을 위해 Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro 및 Ania Straatman-Iwanowska에게 감사드립니다. 또한 Stefan 연구실 멤버들과 Ian J. White에게 도움이 되는 토론에 감사드립니다. J.J.B.는 UCL의 MRC 분자 세포 생물학 연구소에 MRC 기금을 지원하여 코드 MC_U12266B을 수여합니다. C.J.S.는 UCL의 분자 세포 생물학 대학 단위의 MRC 실험실에 MRC 기금으로 지원되며, 코드 MC_UU_00012/6을 수여합니다. P.G.는 유럽 연구위원회 (European Research Council)의 보조금 코드 ERC-2013-StG-337057이 자금을 지원합니다.

Materials

0.22 µm syringe filter Sarstedt 83.1826.001
Aluminum trays Agar Scientific AGG3912
Amira v6 ThermoFisher https://www.thermofisher.com
Chloroform Fisher C/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride TAAB T027 Epon ingredient
Diamond knife DiaTOME ultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol TAAB D032 Epon ingredient
Dumont Tweezers N5 Agar Scientific AGT5293
Fiji https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 plugin https://imagej.net/
Formaldehyde 36% solution TAAB F003
Formvar coated slot grid Homemade Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)
Glass bottle with applicator rod Medisca 6258
Glass vials Fisher Scientific 15364769
Gluteraldehyde 25% solution TAAB G011
MNA/Methyl Nadic Anhydride TAAB M011 Epon ingredient
Osmium Tetroxide 2% solution TAAB O005
Potassium Ferricyanide Sigma-Aldrich P-8131
Propylene oxide Fisher Scientific E/0050/PB08
Reuseable adhesive Blue Tack
Reynolds Lead Citrate TAAB L037 Section stain
Sodium Cacodylate Sigma-Aldrich C-0250 to make 0.1 M Caco buffer
Super Glue RS Components 918-6872 Cyanoacrylate glue, Step 1.3
TAAB 812 Resin TAAB T023 Epon ingredient
Tannic acid TAAB T046
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
Two part Epoxy Resin RS Components 132-605 Alternative: Step 2.13
Ultramicrotome Leica UC7
Vibrating microtome Leica 100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .
Weldwood Original Contact cement DAP 107 Contact adhesive: Step 3.1.4
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Riferimenti

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3D ReconstructionInterorganelle Contact SitesHepatocytesSerial Section Electron MicroscopyOrganelle MorphologyCellular TraffickingUltra-thin SectioningMicrotomeDiamond KnifeCutting WindowRibbon SectioningSlot Grid
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Chun Chung, G. H., Gissen, P., Stefan, C. J., Burden, J. J. Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (184), e63496, doi:10.3791/63496 (2022).
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