Ett enkelt och omfattande protokoll för att förvärva tredimensionella detaljer om membrankontaktställen mellan organeller i hepatocyter från levern eller celler i andra vävnader.
Transmissionselektronmikroskopi har länge ansetts vara guldstandarden för visualisering av cellulär ultrastruktur. Analysen är emellertid ofta begränsad till två dimensioner, vilket hindrar förmågan att fullt ut beskriva den tredimensionella (3D) ultrastrukturen och det funktionella förhållandet mellan organeller. Volymelektronmikroskopi (vEM) beskriver en samling tekniker som möjliggör förhör av cellulär ultrastruktur i 3D vid mesoskala, mikroskala och nanoskala upplösningar.
Detta protokoll ger en tillgänglig och robust metod för att hämta vEM-data med hjälp av seriell sektionsöverföring EM (TEM) och täcker de tekniska aspekterna av provbearbetning till digital 3D-rekonstruktion i ett enda, enkelt arbetsflöde. För att demonstrera användbarheten av denna teknik presenteras det ultrastrukturella 3D-förhållandet mellan endoplasmatisk retikulum och mitokondrier och deras kontaktställen i leverhepatocyter. Interorganelle kontakter tjänar viktiga roller vid överföring av joner, lipider, näringsämnen och andra små molekyler mellan organeller. Men trots deras första upptäckt i hepatocyter finns det fortfarande mycket att lära sig om deras fysiska egenskaper, dynamik och funktioner.
Interorganellkontakter kan visa en rad morfologier, som varierar i närheten av de två organellerna till varandra (vanligtvis ~ 10-30 nm) och omfattningen av kontaktplatsen (från punkterade kontakter till större 3D-cisternalliknande kontakter). Undersökningen av nära kontakter kräver högupplöst avbildning, och seriell sektion TEM är väl lämpad för att visualisera 3D-ultrastrukturell av interorganella kontakter under hepatocytdifferentiering, liksom förändringar i hepatocytarkitektur i samband med metaboliska sjukdomar.
Sedan deras uppfinning på 1930-talet har elektronmikroskop gjort det möjligt för forskare att visualisera de strukturella komponenterna i celler och vävnader 1,2. De flesta undersökningar har gett 2D-information, eftersom byggandet av 3D-modeller kräver noggrann seriell sektionssamling, manuell fotografering, negativ bearbetning, manuell spårning och skapande och montering av 3D-modeller från glasskivor, plast eller styrofoam 3,4. Nästan 70 år senare har det skett betydande framsteg inom många aspekter av processen, från mikroskopprestanda, seriell sektionssamling, automatiserad digital bildbehandling, sofistikerad programvara och hårdvara för 3D-rekonstruktion, visualisering och analys till alternativa metoder för det som nu kollektivt kallas volym EM (vEM). Dessa vEM-tekniker anses i allmänhet ge 3D-ultrastrukturell information vid nanometerupplösningar över mikronskalor och omfattar transmissionselektronmikroskopi (TEM) och nyare svepelektronmikroskopi (SEM) -tekniker; se recensioner 5,6,7,8.
Till exempel använder fokuserad jonstråle SEM (FIB-SEM) en fokuserad jonstråle inuti en SEM för att fräsa bort blockets yta mellan sekventiella SEM-avbildningsskanningar av blockets yta, vilket möjliggör upprepad automatiserad fräsning / avbildning av ett prov och bygger upp en 3D-dataset för rekonstruktion 9,10. Däremot använder seriell blockyta SEM (SBF-SEM) ett ultramikrotom inuti SEM för att ta bort material från blockytan före avbildning 11,12, medan arraytomografi är en icke-destruktiv process som kräver insamling av seriella sektioner, på täckglas, skivor eller tejp, innan du skapar ett automatiserat arbetsflöde för avbildning av regionen av intresse i sekventiella sektioner i SEM för att generera 3D-datauppsättningen13 . I likhet med matristomografi kräver seriell sektion TEM (ssTEM) att fysiska sektioner samlas in före avbildning; Dessa avsnitt samlas dock in på TEM-rutnät och avbildas i en TEM 14,15,16. ssTEM kan utökas genom att utföra lutningstomografi 17,18,19. Seriell lutningstomografi ger den bästa upplösningen i x, y och z, och även om den har använts för att rekonstruera hela celler20 är det rimligt utmanande. Det här protokollet fokuserar på de praktiska aspekterna av ssTEM som den mest tillgängliga vEM-tekniken som är tillgänglig för många EM-laboratorier som kanske för närvarande inte har tillgång till specialiserade sektionerings- eller vEM-instrument men som skulle dra nytta av att generera 3D vEM-data.
Seriell ultramikrotomi för 3D-rekonstruktion har tidigare ansetts utmanande. Det var svårt att klippa raka band med jämn sektionstjocklek, kunna ordna och plocka upp band av rätt storlek, i rätt ordning, på galler med tillräckligt stöd, men utan gallerstänger som döljer intressanta regioner, och viktigast av allt, utan att förlora sektioner, eftersom en ofullständig serie kan förhindra fullständig 3D-rekonstruktion21. Förbättringar av kommersiella ultramikrotom, diamantskärnings- och trimningsknivar22,23, elektronlucentstödfilmer på galler21,24 och lim för att hjälpa till med sektionsvidhäftning och bandbevarande13,21 är dock bara några av de inkrementella framstegen genom åren som har gjort tekniken mer rutinmässig i många laboratorier. När seriella sektioner har samlats in är seriell avbildning i TEM enkel och kan ge EM-bilder med subnanometer px-storlekar i x och y, vilket möjliggör högupplöst förhör av de subcellulära strukturerna – ett potentiellt krav för många forskningsfrågor. Fallstudien som presenteras här visar användningen av ssTEM- och 3D-rekonstruktion i studien av endoplasmatisk retikulum (ER) -organellkontakter i leverhepatocyter, där ER-organellkontakter först observerades25,26.
Samtidigt som den är sammanhängande med kärnhöljet, gör ER också nära kontakter med många andra cellorganeller, inklusive lysosomer, mitokondrier, lipiddroppar och plasmamembranet27. ER-organellkontakter har varit inblandade i lipidmetabolism28, fosfoinositid och kalciumsignalering29, autofagireglering och stressrespons30,31. ER-organellkontakterna och andra interorganellkontakter är mycket dynamiska strukturer som svarar på cellulära metaboliska behov och extracellulära signaler. De har visat sig variera morfologiskt i storlek och form och avstånden mellan organellmembran32,33. Man tror att dessa ultrastrukturella skillnader sannolikt kommer att återspegla deras olika protein / lipidkompositioner och funktion34,35. Det är dock fortfarande en utmanande uppgift att definiera interorganellerande kontakter och analysera dem36. Därför krävs ett tillförlitligt men ändå enkelt protokoll för att undersöka och karakterisera interorganellerkontakter för vidare undersökningar.
Eftersom ER-organellkontakter kan sträcka sig från 10 till 30 nm i membran-till-membranseparation har guldstandarden för identifiering historiskt varit TEM. TEM med tunn sektion har avslöjat specifik subdomänlokalisering för bosatta ER-proteiner vid distinkta membrankontakter37. Traditionellt har detta avslöjat ER-organellkontakter med nm-upplösning men ofta bara presenterat en 2D-bild av dessa interaktioner. VEM-metoder avslöjar dock den ultrastrukturella presentationen och sammanhanget för dessa kontaktplatser i 3D, vilket möjliggör fullständig rekonstruktion av kontakter och mer exakt klassificering av kontakter (punkt kontra rörformig kontra cisternalliknande) och kvantifiering38,39. Förutom att vara den första celltypen där ER-organellkontakter observerades25,26, har hepatocyter ett omfattande system av andra interorganellkontakter som tjänar viktiga roller i deras arkitektur och fysiologi28,40. Emellertid saknas fortfarande en grundlig morfologisk karakterisering av ER-organell och andra interorganellkontakter i hepatocyter. Följaktligen är hur interorganella kontakter bildas och ombyggs under regenerering och reparation av särskild relevans för hepatocytbiologi och leverfunktion.
En tillgänglig vEM-teknik för att visualisera organellstruktur och interaktioner i 3D beskrivs i detta protokoll. Morfologin hos interorganellkontakter i hepatocyter presenteras som en fallstudie här. Detta tillvägagångssätt har emellertid också tillämpats för att undersöka en mängd andra prover och forskningsområden, inklusive Schwann-cell-endotelinteraktioner i perifera nerver45, Weibel Palade Body biogenes i endotelceller46, lastsekretion i njurceller<sup cla…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro och Ania Straatman-Iwanowska för teknisk experthjälp. Vi tackar också Stefan lab-medlemmar och Ian J. White för hjälpsamma diskussioner. J.J.B. stöds av MRC-finansiering till MRC Laboratory of Molecular Cell Biology vid UCL, tilldelningskod MC_U12266B. C.J.S. stöds av MRC-finansiering till MRC Laboratory of Molecular Cell Biology University Unit vid UCL, tilldelningskod MC_UU_00012/6. P.G. finansieras av Europeiska forskningsrådet, bidragskod ERC-2013-StG-337057.
0.22 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
Aluminum trays | Agar Scientific | AGG3912 | |
Amira v6 | ThermoFisher | https://www.thermofisher.com | |
Chloroform | Fisher | C/4960/PB08 | |
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride | TAAB | T027 | Epon ingredient |
Diamond knife | DiaTOME | ultra 45° | |
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol | TAAB | D032 | Epon ingredient |
Dumont Tweezers N5 | Agar Scientific | AGT5293 | |
Fiji | https://imagej.net/ | ||
Fiji TrakEM2 plugin | https://imagej.net/ | ||
Formaldehyde 36% solution | TAAB | F003 | |
Formvar coated slot grid | Homemade | Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu) | |
Glass bottle with applicator rod | Medisca | 6258 | |
Glass vials | Fisher Scientific | 15364769 | |
Gluteraldehyde 25% solution | TAAB | G011 | |
MNA/Methyl Nadic Anhydride | TAAB | M011 | Epon ingredient |
Osmium Tetroxide 2% solution | TAAB | O005 | |
Potassium Ferricyanide | Sigma-Aldrich | P-8131 | |
Propylene oxide | Fisher Scientific | E/0050/PB08 | |
Reuseable adhesive | Blue Tack | ||
Reynolds Lead Citrate | TAAB | L037 | Section stain |
Sodium Cacodylate | Sigma-Aldrich | C-0250 | to make 0.1 M Caco buffer |
Super Glue | RS Components | 918-6872 | Cyanoacrylate glue, Step 1.3 |
TAAB 812 Resin | TAAB | T023 | Epon ingredient |
Tannic acid | TAAB | T046 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Two part Epoxy Resin | RS Components | 132-605 | Alternative: Step 2.13 |
Ultramicrotome | Leica | UC7 | |
Vibrating microtome | Leica | 100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude . | |
Weldwood Original Contact cement | DAP | 107 | Contact adhesive: Step 3.1.4 |