Karaciğerden hepatositlerdeki organeller veya diğer dokulardaki hücreler arasındaki membran temas bölgelerinin üç boyutlu ayrıntılarını elde etmek için basit ve kapsamlı bir protokoldür.
İletim elektron mikroskobu, uzun zamandır hücresel ultrayapının görselleştirilmesi için altın standart olarak kabul edilmiştir. Bununla birlikte, analiz genellikle iki boyutla sınırlıdır ve organeller arasındaki üç boyutlu (3D) ultra yapıyı ve fonksiyonel ilişkiyi tam olarak tanımlama yeteneğini engeller. Hacim elektron mikroskobu (vEM), hücresel ultrayapının mezo ölçekte, mikro ölçekte ve nano ölçekli çözünürlüklerde 3D olarak sorgulanmasını sağlayan tekniklerin bir koleksiyonunu tanımlar.
Bu protokol, seri kesit iletimi EM’sini (TEM) kullanarak vEM verilerini elde etmek için erişilebilir ve sağlam bir yöntem sağlar ve numune işlemenin teknik yönlerini tek, basit bir iş akışında dijital 3D rekonstrüksiyona kadar kapsar. Bu tekniğin yararlılığını göstermek için, endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki 3D ultrastrüktürel ilişki ve karaciğer hepatositlerindeki temas bölgeleri sunulmuştur. Organeller arası temaslar, iyonların, lipitlerin, besinlerin ve diğer küçük moleküllerin organeller arasındaki transferinde hayati rol oynar. Bununla birlikte, hepatositlerdeki ilk keşiflerine rağmen, fiziksel özellikleri, dinamikleri ve işlevleri hakkında öğrenilecek çok şey var.
Organeller arası temaslar, iki organelin birbirine yakınlığında (tipik olarak ~ 10-30 nm) ve temas bölgesinin kapsamında (noktalama kontaklarından daha büyük 3D sarnıç benzeri kontaklara kadar) değişen bir dizi morfoloji görüntüleyebilir. Yakın temaslıların incelenmesi yüksek çözünürlüklü görüntüleme gerektirir ve seri kesit TEM, hepatosit farklılaşması sırasında organeller arası temasların 3D ultrastrüksiyonunu ve metabolik hastalıklarla ilişkili hepatosit mimarisindeki değişiklikleri görselleştirmek için çok uygundur.
1930’lardaki icatlarından bu yana, elektron mikroskopları araştırmacıların hücrelerin ve dokuların yapısal bileşenlerini görselleştirmelerine izin verdi 1,2. Çoğu araştırma, 3D modeller oluşturmak için özenli seri bölüm toplama, manuel fotoğrafçılık, negatif işleme, manuel izleme ve cam, plastik veya strafor 3,4 tabakalarından 3D modellerin oluşturulması ve montajı gerektiğinden, 2D bilgi sağlamıştır. Neredeyse 70 yıl sonra, mikroskop performansı, seri bölüm toplama, otomatik dijital görüntüleme, 3D rekonstrüksiyon, görselleştirme ve analiz için sofistike yazılım ve donanımdan, şimdi toplu olarak hacim EM (vEM) olarak adlandırılan alternatif yaklaşımlara kadar, sürecin birçok alanında önemli ilerlemeler olmuştur. Bu vEM tekniklerinin genellikle mikron ölçeklerinde nanometre çözünürlüklerinde 3D ultrayapısal bilgi sağladığı ve iletim elektron mikroskobu (TEM) ve daha yeni taramalı elektron mikroskobu (SEM) tekniklerini kapsadığı düşünülmektedir; Bkz.yorumlar 5,6,7,8.
Örneğin, odaklanmış iyon ışını SEM (FIB-SEM), bloğun yüzeyinin sıralı SEM görüntüleme taramaları arasında bloğun yüzeyini frezelemek için bir SEM içinde odaklanmış bir iyon ışını kullanır, böylece bir numunenin tekrarlanan otomatik frezelenmesine / görüntülenmesine ve yeniden yapılanma için bir 3D veri kümesi oluşturulmasına izin verir 9,10. Buna karşılık, seri blok yüzü SEM (SBF-SEM), görüntüleme 11,12’den önce blok yüzünden materyali çıkarmak için SEM içinde bir ultramikrotom kullanırken, dizi tomografisi, 3D veri kümesini oluşturmak için SEM’deki sıralı bölümlerdeki ilgi alanını görüntülemek için otomatik bir iş akışı kurmadan önce, seri bölümlerin, kapaklara, gofretlere veya bantlara toplanmasını gerektiren tahribatsız bir işlemdir13 . Dizi tomografisine benzer şekilde, seri kesit TEM (ssTEM), fiziksel kesitlerin görüntülemeden önce toplanmasını gerektirir; ancak, bu bölümler TEM ızgaralarında toplanır ve bir TEM 14,15,16’da görüntülenir. ssTEM tilt tomografi17,18,19 yapılarak genişletilebilir. Seri eğimli tomografi x, y ve z’de en iyi çözünürlüğü sağlar ve tüm hücreleri20 yeniden yapılandırmak için kullanılmış olsa da, oldukça zordur. Bu protokol, şu anda özel bölümleme veya vEM cihazlarına erişimi olmayan ancak 3D vEM verileri oluşturmaktan fayda sağlayacak birçok EM laboratuvarı için mevcut olan en erişilebilir vEM tekniği olarak ssTEM’in pratik yönlerine odaklanmaktadır.
3D rekonstrüksiyon için seri ultramikrotomi daha önce zor olarak kabul edildi. Eşit kesit kalınlığındaki düz şeritleri kesmek, doğru boyuttaki şeritleri doğru sırayla, yeterli desteğe sahip ızgaralara yerleştirebilmek ve alabilmek zordu, ancak ilgi alanlarını gizleyen ızgara çubukları olmadan ve en önemlisi, bölümleri kaybetmeden, tamamlanmamış bir seri tam 3D rekonstrüksiyonu önleyebilir21. Bununla birlikte, ticari ultramikrotomlar, elmas kesme ve kırpma bıçakları 22,23, ızgaralar 21,24 üzerindeki elektron parlaklığı destek filmleri ve kesit yapışmasına ve şerit korumasına yardımcı olmak için yapıştırıcılar 13,21’deki iyileştirmeler, tekniği birçok laboratuvarda daha rutin hale getiren yıllar içindeki artan gelişmelerden sadece birkaçıdır. Seri kesitler toplandıktan sonra, TEM’deki seri görüntüleme basittir ve x ve y cinsinden subnanometre px boyutlarına sahip EM görüntüleri sağlayabilir ve hücre altı yapıların yüksek çözünürlüklü sorgulanmasına izin verebilir – birçok araştırma sorusu için potansiyel bir gereklilik. Burada sunulan vaka çalışması, karaciğer hepatositlerinde endoplazmik retikulum (ER)-organel temaslarının incelenmesinde ssTEM ve 3D rekonstrüksiyonun kullanımını göstermektedir ve burada ER-organel temasları ilk kez gözlenmiştir25,26.
Nükleer zarfla bitişik olmakla birlikte, ER ayrıca lizozomlar, mitokondri, lipit damlacıkları ve plazma zarı27 dahil olmak üzere çok sayıda diğer hücre organelleriyle yakın temas kurar. ER-organel temasları lipid metabolizması28, fosfoinositid ve kalsiyum sinyalizasyonu29, otofaji regülasyonu ve stres yanıtı30,31 ile ilişkilendirilmiştir. ER-organel temasları ve diğer organeller arası temaslar, hücresel metabolik ihtiyaçlara ve hücre dışı ipuçlarına cevap veren oldukça dinamik yapılardır. Morfolojik olarak boyut ve şekillerinde ve organel zarları arasındaki mesafelerde32,33 olarak değiştiği gösterilmiştir. Bu ultrastrüktürel farklılıkların farklı protein/lipid bileşimlerini yansıtması ve34,35 fonksiyonunu yansıtması muhtemeldir. Bununla birlikte, organlar arası temasları tanımlamak ve bunları analiz etmek hala zor bir görevdir36. Bu nedenle, daha ileri araştırmalar için organlar arası temasları incelemek ve karakterize etmek için güvenilir ancak basit bir protokol gereklidir.
ER-organel kontakları membrandan membrana ayırmada 10 ila 30 nm arasında değişebildiğinden, tanımlama için altın standart tarihsel olarak TEM olmuştur. İnce kesitli TEM, farklı membran temaslarında yerleşik ER proteinleri için spesifik alt alan lokalizasyonu ortaya koymuştur37. Geleneksel olarak, bu, nm çözünürlüklü ER-organel temaslarını ortaya çıkarmıştır, ancak genellikle bu etkileşimlerin yalnızca 2D bir görünümünü sunmuştur. Bununla birlikte, vEM yaklaşımları, bu temas bölgelerinin ultrayapısal sunumunu ve bağlamını 3D olarak ortaya koyarak, temasların tam olarak yeniden yapılandırılmasını ve kontakların daha doğru sınıflandırılmasını (nokta vs boru şeklindeki ve sarnıç benzeri) ve nicelleştirme38,39’u mümkün kılmaktadır. ER-organel temaslarının 25,26 gözlendiği ilk hücre tipi olmasının yanı sıra, hepatositler mimarilerinde ve fizyolojilerinde hayati roller üstlenen diğer organeller arası temaslardan oluşan kapsamlı bir sisteme sahiptir28,40. Bununla birlikte, hepatositlerde ER-organel ve diğer interorganel temaslarının tam morfolojik karakterizasyonu hala eksiktir. Buna göre, rejenerasyon ve onarım sırasında organeller arası temasların nasıl oluştuğu ve yeniden şekillendiği, hepatosit biyolojisi ve karaciğer fonksiyonu ile özellikle ilgilidir.
Organel yapısını ve etkileşimlerini 3D olarak görselleştirmek için erişilebilir bir vEM tekniği bu protokolde açıklanmıştır. Hepatositlerde interorganel temaslarının morfolojisi burada bir vaka çalışması olarak sunulmuştur. Bununla birlikte, bu yaklaşım, periferik sinirlerde Schwann hücresi-endotel etkileşimleri 45, endotel hücrelerinde Weibel Palade Vücut biyogenezi46, böbrek hücrelerinde kargo sekresyonu47 ve hipokampal nöronlarda sinaps morf…
The authors have nothing to disclose.
Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro ve Ania Straatman-Iwanowska’ya uzman teknik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca yararlı tartışmalar için Stefan laboratuvar üyelerine ve Ian J. White’a teşekkür ederiz. J.J.B., UCL’deki MRC Moleküler Hücre Biyolojisi MRC Laboratuvarı’na, ödül kodu MC_U12266B MRC finansmanı ile desteklenmektedir. C.J.S., UCL’deki Moleküler Hücre Biyolojisi Üniversite Birimi MRC Laboratuvarı’na MRC finansmanı ile desteklenmektedir, ödül kodu MC_UU_00012/6. P.G., Avrupa Araştırma Konseyi, hibe kodu ERC-2013-StG-337057 tarafından finanse edilmektedir.
0.22 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
Aluminum trays | Agar Scientific | AGG3912 | |
Amira v6 | ThermoFisher | https://www.thermofisher.com | |
Chloroform | Fisher | C/4960/PB08 | |
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride | TAAB | T027 | Epon ingredient |
Diamond knife | DiaTOME | ultra 45° | |
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol | TAAB | D032 | Epon ingredient |
Dumont Tweezers N5 | Agar Scientific | AGT5293 | |
Fiji | https://imagej.net/ | ||
Fiji TrakEM2 plugin | https://imagej.net/ | ||
Formaldehyde 36% solution | TAAB | F003 | |
Formvar coated slot grid | Homemade | Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu) | |
Glass bottle with applicator rod | Medisca | 6258 | |
Glass vials | Fisher Scientific | 15364769 | |
Gluteraldehyde 25% solution | TAAB | G011 | |
MNA/Methyl Nadic Anhydride | TAAB | M011 | Epon ingredient |
Osmium Tetroxide 2% solution | TAAB | O005 | |
Potassium Ferricyanide | Sigma-Aldrich | P-8131 | |
Propylene oxide | Fisher Scientific | E/0050/PB08 | |
Reuseable adhesive | Blue Tack | ||
Reynolds Lead Citrate | TAAB | L037 | Section stain |
Sodium Cacodylate | Sigma-Aldrich | C-0250 | to make 0.1 M Caco buffer |
Super Glue | RS Components | 918-6872 | Cyanoacrylate glue, Step 1.3 |
TAAB 812 Resin | TAAB | T023 | Epon ingredient |
Tannic acid | TAAB | T046 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Two part Epoxy Resin | RS Components | 132-605 | Alternative: Step 2.13 |
Ultramicrotome | Leica | UC7 | |
Vibrating microtome | Leica | 100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude . | |
Weldwood Original Contact cement | DAP | 107 | Contact adhesive: Step 3.1.4 |