Tredimensionell karakterisering av interorganella kontaktställen i hepatocyter med användning av seriell sektionselektronmikroskopi

Summary

Ett enkelt och omfattande protokoll för att förvärva tredimensionella detaljer om membrankontaktställen mellan organeller i hepatocyter från levern eller celler i andra vävnader.

Abstract

Transmissionselektronmikroskopi har länge ansetts vara guldstandarden för visualisering av cellulär ultrastruktur. Analysen är emellertid ofta begränsad till två dimensioner, vilket hindrar förmågan att fullt ut beskriva den tredimensionella (3D) ultrastrukturen och det funktionella förhållandet mellan organeller. Volymelektronmikroskopi (vEM) beskriver en samling tekniker som möjliggör förhör av cellulär ultrastruktur i 3D vid mesoskala, mikroskala och nanoskala upplösningar.

Detta protokoll ger en tillgänglig och robust metod för att hämta vEM-data med hjälp av seriell sektionsöverföring EM (TEM) och täcker de tekniska aspekterna av provbearbetning till digital 3D-rekonstruktion i ett enda, enkelt arbetsflöde. För att demonstrera användbarheten av denna teknik presenteras det ultrastrukturella 3D-förhållandet mellan endoplasmatisk retikulum och mitokondrier och deras kontaktställen i leverhepatocyter. Interorganelle kontakter tjänar viktiga roller vid överföring av joner, lipider, näringsämnen och andra små molekyler mellan organeller. Men trots deras första upptäckt i hepatocyter finns det fortfarande mycket att lära sig om deras fysiska egenskaper, dynamik och funktioner.

Interorganellkontakter kan visa en rad morfologier, som varierar i närheten av de två organellerna till varandra (vanligtvis ~ 10-30 nm) och omfattningen av kontaktplatsen (från punkterade kontakter till större 3D-cisternalliknande kontakter). Undersökningen av nära kontakter kräver högupplöst avbildning, och seriell sektion TEM är väl lämpad för att visualisera 3D-ultrastrukturell av interorganella kontakter under hepatocytdifferentiering, liksom förändringar i hepatocytarkitektur i samband med metaboliska sjukdomar.

Introduction

Sedan deras uppfinning på 1930-talet har elektronmikroskop gjort det möjligt för forskare att visualisera de strukturella komponenterna i celler och vävnader ^1,2. De flesta undersökningar har gett 2D-information, eftersom byggandet av 3D-modeller kräver noggrann seriell sektionssamling, manuell fotografering, negativ bearbetning, manuell spårning och skapande och montering av 3D-modeller från glasskivor, plast eller styrofoam ^3,4. Nästan 70 år senare har det skett betydande framsteg inom många aspekter av processen, från mikroskopprestanda, seriell sektionssamling, automatiserad digital bildbehandling, sofistikerad programvara och hårdvara för 3D-rekonstruktion, visualisering och analys till alternativa metoder för det som nu kollektivt kallas volym EM (vEM). Dessa vEM-tekniker anses i allmänhet ge 3D-ultrastrukturell information vid nanometerupplösningar över mikronskalor och omfattar transmissionselektronmikroskopi (TEM) och nyare svepelektronmikroskopi (SEM) -tekniker; se recensioner 5,6,7,8.

Till exempel använder fokuserad jonstråle SEM (FIB-SEM) en fokuserad jonstråle inuti en SEM för att fräsa bort blockets yta mellan sekventiella SEM-avbildningsskanningar av blockets yta, vilket möjliggör upprepad automatiserad fräsning / avbildning av ett prov och bygger upp en 3D-dataset för rekonstruktion ^9,10. Däremot använder seriell blockyta SEM (SBF-SEM) ett ultramikrotom inuti SEM för att ta bort material från blockytan före avbildning ^11,12, medan arraytomografi är en icke-destruktiv process som kräver insamling av seriella sektioner, på täckglas, skivor eller tejp, innan du skapar ett automatiserat arbetsflöde för avbildning av regionen av intresse i sekventiella sektioner i SEM för att generera 3D-datauppsättningen¹³ . I likhet med matristomografi kräver seriell sektion TEM (ssTEM) att fysiska sektioner samlas in före avbildning; Dessa avsnitt samlas dock in på TEM-rutnät och avbildas i en TEM 14,15,16. ssTEM kan utökas genom att utföra lutningstomografi 17,18,19. Seriell lutningstomografi ger den bästa upplösningen i x, y och z, och även om den har använts för att rekonstruera hela celler²⁰ är det rimligt utmanande. Det här protokollet fokuserar på de praktiska aspekterna av ssTEM som den mest tillgängliga vEM-tekniken som är tillgänglig för många EM-laboratorier som kanske för närvarande inte har tillgång till specialiserade sektionerings- eller vEM-instrument men som skulle dra nytta av att generera 3D vEM-data.

Seriell ultramikrotomi för 3D-rekonstruktion har tidigare ansetts utmanande. Det var svårt att klippa raka band med jämn sektionstjocklek, kunna ordna och plocka upp band av rätt storlek, i rätt ordning, på galler med tillräckligt stöd, men utan gallerstänger som döljer intressanta regioner, och viktigast av allt, utan att förlora sektioner, eftersom en ofullständig serie kan förhindra fullständig 3D-rekonstruktion²¹. Förbättringar av kommersiella ultramikrotom, diamantskärnings- och trimningsknivar^22,23, elektronlucentstödfilmer på galler^21,24 och lim för att hjälpa till med sektionsvidhäftning och bandbevarande^13,21 är dock bara några av de inkrementella framstegen genom åren som har gjort tekniken mer rutinmässig i många laboratorier. När seriella sektioner har samlats in är seriell avbildning i TEM enkel och kan ge EM-bilder med subnanometer px-storlekar i x och y, vilket möjliggör högupplöst förhör av de subcellulära strukturerna – ett potentiellt krav för många forskningsfrågor. Fallstudien som presenteras här visar användningen av ssTEM- och 3D-rekonstruktion i studien av endoplasmatisk retikulum (ER) -organellkontakter i leverhepatocyter, där ER-organellkontakter först observerades^25,26.

Samtidigt som den är sammanhängande med kärnhöljet, gör ER också nära kontakter med många andra cellorganeller, inklusive lysosomer, mitokondrier, lipiddroppar och plasmamembranet²⁷. ER-organellkontakter har varit inblandade i lipidmetabolism²⁸, fosfoinositid och kalciumsignalering²⁹, autofagireglering och stressrespons^30,31. ER-organellkontakterna och andra interorganellkontakter är mycket dynamiska strukturer som svarar på cellulära metaboliska behov och extracellulära signaler. De har visat sig variera morfologiskt i storlek och form och avstånden mellan organellmembran^32,33. Man tror att dessa ultrastrukturella skillnader sannolikt kommer att återspegla deras olika protein / lipidkompositioner och funktion^34,35. Det är dock fortfarande en utmanande uppgift att definiera interorganellerande kontakter och analysera dem³⁶. Därför krävs ett tillförlitligt men ändå enkelt protokoll för att undersöka och karakterisera interorganellerkontakter för vidare undersökningar.

Eftersom ER-organellkontakter kan sträcka sig från 10 till 30 nm i membran-till-membranseparation har guldstandarden för identifiering historiskt varit TEM. TEM med tunn sektion har avslöjat specifik subdomänlokalisering för bosatta ER-proteiner vid distinkta membrankontakter³⁷. Traditionellt har detta avslöjat ER-organellkontakter med nm-upplösning men ofta bara presenterat en 2D-bild av dessa interaktioner. VEM-metoder avslöjar dock den ultrastrukturella presentationen och sammanhanget för dessa kontaktplatser i 3D, vilket möjliggör fullständig rekonstruktion av kontakter och mer exakt klassificering av kontakter (punkt kontra rörformig kontra cisternalliknande) och kvantifiering^38,39. Förutom att vara den första celltypen där ER-organellkontakter observerades^25,26, har hepatocyter ett omfattande system av andra interorganellkontakter som tjänar viktiga roller i deras arkitektur och fysiologi^28,40. Emellertid saknas fortfarande en grundlig morfologisk karakterisering av ER-organell och andra interorganellkontakter i hepatocyter. Följaktligen är hur interorganella kontakter bildas och ombyggs under regenerering och reparation av särskild relevans för hepatocytbiologi och leverfunktion.

Protocol

Alla djur inhystes i enlighet med det brittiska inrikesministeriets riktlinjer, och vävnadsskörden utfördes i enlighet med UK Animal (Scientific Procedures) Act 1986. 1. Provfixering och beredning Dissekera levervävnaden i lämpliga storleksbitar, cirka 8 mm x 8 mm x 3 mm, och placera bitarna i varm fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 37 °C). Injicera rumstemperatur (20-25 ° C) fixativ (1,5% glutaraldehyd i 1% sackaros, 0,1 M natriumkakodylat) i leverbit…

Representative Results

För denna teknik väljs regioner av intresse utifrån det biologiska forskningsmålet och identifieras före trimning och sektionering av inbäddad vävnad. På samma sätt kan storleken på blockytan dikteras av forskningsfrågan; I detta fall trimmades provet för att lämna en blockyta på cirka 0,3 mm x 0,15 mm (figur 4A). Detta möjliggjorde två rutnät med 9 seriella sektioner per rutnät, vilket gav 18 seriella sektioner och införlivade en volym levervävnad med en volym av cirka 6…

Discussion

En tillgänglig vEM-teknik för att visualisera organellstruktur och interaktioner i 3D beskrivs i detta protokoll. Morfologin hos interorganellkontakter i hepatocyter presenteras som en fallstudie här. Detta tillvägagångssätt har emellertid också tillämpats för att undersöka en mängd andra prover och forskningsområden, inklusive Schwann-cell-endotelinteraktioner i perifera nerver⁴⁵, Weibel Palade Body biogenes i endotelceller⁴⁶, lastsekretion i njurceller<sup cla…

Materials

0.22 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
Aluminum trays	Agar Scientific	AGG3912
Amira v6	ThermoFisher		https://www.thermofisher.com
Chloroform	Fisher	C/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride	TAAB	T027	Epon ingredient
Diamond knife	DiaTOME	ultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol	TAAB	D032	Epon ingredient
Dumont Tweezers N5	Agar Scientific	AGT5293
Fiji			https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 plugin			https://imagej.net/
Formaldehyde 36% solution	TAAB	F003
Formvar coated slot grid	Homemade		Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)
Glass bottle with applicator rod	Medisca	6258
Glass vials	Fisher Scientific	15364769
Gluteraldehyde 25% solution	TAAB	G011
MNA/Methyl Nadic Anhydride	TAAB	M011	Epon ingredient
Osmium Tetroxide 2% solution	TAAB	O005
Potassium Ferricyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene oxide	Fisher Scientific	E/0050/PB08
Reuseable adhesive	Blue Tack
Reynolds Lead Citrate	TAAB	L037	Section stain
Sodium Cacodylate	Sigma-Aldrich	C-0250	to make 0.1 M Caco buffer
Super Glue	RS Components	918-6872	Cyanoacrylate glue, Step 1.3
TAAB 812 Resin	TAAB	T023	Epon ingredient
Tannic acid	TAAB	T046
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Two part Epoxy Resin	RS Components	132-605	Alternative: Step 2.13
Ultramicrotome	Leica	UC7
Vibrating microtome	Leica		100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .
Weldwood Original Contact cement	DAP	107	Contact adhesive: Step 3.1.4