Tredimensjonal karakterisering av Interorganelle kontaktsteder i Hepatocytter ved hjelp av seriell seksjon elektronmikroskopi

Summary

En enkel og omfattende protokoll for å skaffe tredimensjonale detaljer om membrankontaktsteder mellom organeller i hepatocytter fra leveren eller cellene i andre vev.

Abstract

Transmisjonselektronmikroskopi har lenge vært ansett for å være gullstandarden for visualisering av cellulær ultrastruktur. Imidlertid er analysen ofte begrenset til to dimensjoner, noe som hemmer evnen til å beskrive den tredimensjonale (3D) ultrastrukturelle og funksjonelle forholdet mellom organeller fullt ut. Volumelektronmikroskopi (vEM) beskriver en samling teknikker som muliggjør forhør av cellulær ultrastruktur i 3D ved mesoskala, mikroskala og nanoskala oppløsninger.

Denne protokollen gir en tilgjengelig og robust metode for å skaffe vEM-data ved hjelp av seriell seksjonsoverføring EM (TEM) og dekker de tekniske aspektene ved prøvebehandling til digital 3D-rekonstruksjon i en enkelt, grei arbeidsflyt. For å demonstrere nytten av denne teknikken presenteres 3D ultrastrukturelle forholdet mellom endoplasmisk retikulum og mitokondrier og deres kontaktsteder i lever hepatocytter. Interorganelle kontakter tjener viktige roller i overføringen av ioner, lipider, næringsstoffer og andre små molekyler mellom organeller. Til tross for deres første oppdagelse i hepatocytter, er det imidlertid fortsatt mye å lære om deres fysiske egenskaper, dynamikk og funksjoner.

Interorganelle kontakter kan vise en rekke morfologier, varierende i nærheten av de to organellene til hverandre (vanligvis ~ 10-30 nm) og omfanget av kontaktstedet (fra punktering av kontakter til større 3D-cisternal-lignende kontakter). Undersøkelsen av nære kontakter krever høyoppløselig avbildning, og seriell seksjon TEM er godt egnet til å visualisere 3D ultrastrukturell interorganelle kontakter under hepatocytdifferensiering, samt endringer i hepatocyttarkitektur forbundet med metabolske sykdommer.

Introduction

Siden oppfinnelsen på 1930-tallet har elektronmikroskoper gjort det mulig for forskere å visualisere strukturkomponentene i celler og vev ^1,2. De fleste undersøkelser har gitt 2D-informasjon, da bygging av 3D-modeller krever omhyggelig seriell seksjonsinnsamling, manuell fotografering, negativ behandling, manuell sporing og opprettelse og montering av 3D-modeller fra glassplater, plast eller Styrofoam ^3,4. Nesten 70 år senere har det vært betydelige fremskritt i mange aspekter av prosessen, fra mikroskopytelse, seriell seksjonssamling, automatisert digital bildebehandling, sofistikert programvare og maskinvare for 3D-rekonstruksjon, visualisering og analyse til alternative tilnærminger for det som nå kalles samlet volum EM (vEM). Disse vEM-teknikkene vurderes generelt å gi 3D ultrastrukturell informasjon ved nanometeroppløsninger på tvers av mikronvekter og omfatter transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og nyere skanningselektronmikroskopiteknikker (SEM). se anmeldelser 5,6,7,8.

For eksempel bruker fokusert ionstråle SEM (FIB-SEM) en fokusert ionstråle inne i en SEM for å frese bort overflaten av blokken mellom sekvensielle SEM-bildeskanninger av blokkens overflate, slik at den gjentatte automatiserte fresingen / avbildningen av en prøve og bygge opp et 3D-datasett for rekonstruksjon ^9,10. I motsetning bruker serieblokkflaten SEM (SBF-SEM) en ultramikrotomi inne i SEM for å fjerne materiale fra blokkflaten før bildebehandling^11,12, mens matrisetomografi er en ikke-ødeleggende prosess som krever innsamling av serielle seksjoner, på coverlips, wafers eller tape, før du setter opp en automatisert arbeidsflyt for avbildning av interesseområdet i sekvensielle seksjoner i SEM for å generere 3D-datasettet¹³ . I likhet med matrisetomografi krever seriell seksjon TEM (ssTEM) at fysiske seksjoner samles inn før avbildning. Disse seksjonene samles imidlertid inn på TEM-rutenett og avbildet i en TEM 14,15,16. ssTEM kan utvides ved å utføre tilt tomografi 17,18,19. Seriell vippetomografi gir den beste oppløsningen i x, y og z, og selv om den har blitt brukt til å rekonstruere hele celler²⁰, er det rimelig utfordrende. Denne protokollen fokuserer på de praktiske aspektene ved ssTEM som den mest tilgjengelige vEM-teknikken som er tilgjengelig for mange EM-laboratorier som for øyeblikket ikke har tilgang til spesialiserte seksjonerings- eller vEM-instrumenter, men som vil ha nytte av å generere 3D vEM-data.

Seriell ultramikrotomi for 3D-rekonstruksjon har tidligere vært ansett som utfordrende. Det var vanskelig å kutte rette bånd av jevn seksjonstykkelse, kunne ordne og plukke opp bånd av riktig størrelse, i riktig rekkefølge, på rutenett med tilstrekkelig støtte, men uten rutenettstenger som skjuler interesseområder, og viktigst av alt, uten å miste seksjoner, da en ufullstendig serie kan forhindre full 3D-rekonstruksjon²¹. Forbedringer av kommersielle ultramikrotomer, diamantskjæring og trimming av kniver ^22,23, elektron lucent støttefilmer på rutenett^21,24, og lim for å hjelpe seksjonsadhesjon og båndbevaring^13,21 er bare noen av de inkrementelle fremskrittene gjennom årene som har gjort teknikken mer rutinemessig i mange laboratorier. Når serielle seksjoner er samlet inn, er seriell bildebehandling i TEM grei og kan gi EM-bilder med subnanometer px størrelser i x og y, slik at høyoppløselig avhør av subcellulære strukturer -et potensielt krav for mange forskningsspørsmål. Casestudien som presenteres her viser bruk av ssTEM og 3D-rekonstruksjon i studiet av endoplasmatisk retikulum (ER)-organelle kontakter i lever hepatocytter, hvor ER-organelle kontakter først ble observert ^25,26.

Mens den er sammenhengende med atomkonvolutten, tar ER også nær kontakt med mange andre celleorganeller, inkludert lysosomer, mitokondrier, lipiddråper og plasmamembranen²⁷. ER-organelle kontakter har vært involvert i lipidmetabolisme²⁸, fosfoinositid og kalsiumsignalering²⁹, autofagiregulering og stressrespons^30,31. ER-organelle kontakter og andre interorganelle kontakter er svært dynamiske strukturer som reagerer på cellulære metabolske behov og ekstracellulære signaler. De har vist seg å variere morfologisk i størrelse og form og avstandene mellom organellemembraner^32,33. Det antas at disse ultrastrukturelle forskjellene sannsynligvis vil gjenspeile deres forskjellige protein / lipidsammensetninger og funksjon^34,35. Det er imidlertid fortsatt en utfordrende oppgave å definere interorganelle kontakter og analysere dem³⁶. Derfor er det nødvendig med en pålitelig, men enkel protokoll for å undersøke og karakterisere interorganelle kontakter for videre undersøkelser.

Siden ER-organelle kontakter kan variere fra 10 til 30 nm i membran-til-membran separasjon, har gullstandarden for identifikasjon historisk vært TEM. Tynnseksjon TEM har avdekket spesifikk lokalisering av underdomene for residente ER-proteiner ved distinkte membrankontakter³⁷. Tradisjonelt har dette avdekket ER-organelle kontakter med NM-oppløsning, men ofte bare presentert en 2D-visning av disse interaksjonene. VEM-tilnærminger avslører imidlertid den ultrastrukturelle presentasjonen og konteksten til disse kontaktsidene i 3D, noe som muliggjør full rekonstruksjon av kontakter og mer nøyaktig klassifisering av kontakter (punkt vs. rørformet vs. cisternal-lignende) og kvantifisering^38,39. I tillegg til å være den første celletypen der ER-organelle kontakter ble observert^25,26, har hepatocytter et omfattende system av andre interorganelle kontakter som tjener viktige roller i deres arkitektur og fysiologi^28,40. Imidlertid mangler fortsatt grundig morfologisk karakterisering av ER-organelle og andre interorganelle kontakter i hepatocytter. Følgelig er hvordan interorganelle kontakter dannes og omdanner under regenerering og reparasjon spesielt relevant for hepatocyt biologi og leverfunksjon.

Protocol

Alle dyrene ble plassert i samsvar med uk Home Office retningslinjer, og vev høsting ble utført i samsvar med UK Animal (Scientific Procedures) Act 1986. 1. Prøvefiksering og forberedelse Disseker levervevet i passende størrelsesstykker, ca. 8 mm x 8 mm x 3 mm, og legg bitene i varm fosfatbufret saltvann (PBS, 37 °C). Injiser romtemperatur (20-25 °C) fikseringsmiddel (1,5% glutaraldehyd i 1% sukrose, 0,1 M natriumkakroktylat) i leverbitene og overfør…

Representative Results

For denne teknikken velges interesseområder basert på det biologiske forskningsmålet og identifiseres før trimning og seksjonering av innebygd vev. På samme måte kan størrelsen på blokkflaten dikteres av forskningsspørsmålet; I dette tilfellet ble prøven trimmet for å etterlate en blokkskive på ca. 0,3 mm x 0,15 mm (figur 4A). Dette tillot to gitter på 9 serielle seksjoner per rutenett, noe som gir 18 serielle seksjoner og inkorporerer et volum levervev på et volum på ca. 62 …

Discussion

En tilgjengelig vEM-teknikk for visualisering av organellstruktur og interaksjoner i 3D er beskrevet i denne protokollen. Morfologien til interorganelle kontakter i hepatocytter presenteres som en casestudie her. Imidlertid har denne tilnærmingen også blitt brukt til å undersøke en rekke andre prøver og forskningsområder, inkludert Schwann celle-endotelinteraksjoner i perifere nerver⁴⁵, Weibel Palade Body biogenese i endotelceller⁴⁶, lastsekresjon i nyreceller<sup cla…

Materials

0.22 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
Aluminum trays	Agar Scientific	AGG3912
Amira v6	ThermoFisher		https://www.thermofisher.com
Chloroform	Fisher	C/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride	TAAB	T027	Epon ingredient
Diamond knife	DiaTOME	ultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol	TAAB	D032	Epon ingredient
Dumont Tweezers N5	Agar Scientific	AGT5293
Fiji			https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 plugin			https://imagej.net/
Formaldehyde 36% solution	TAAB	F003
Formvar coated slot grid	Homemade		Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)
Glass bottle with applicator rod	Medisca	6258
Glass vials	Fisher Scientific	15364769
Gluteraldehyde 25% solution	TAAB	G011
MNA/Methyl Nadic Anhydride	TAAB	M011	Epon ingredient
Osmium Tetroxide 2% solution	TAAB	O005
Potassium Ferricyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene oxide	Fisher Scientific	E/0050/PB08
Reuseable adhesive	Blue Tack
Reynolds Lead Citrate	TAAB	L037	Section stain
Sodium Cacodylate	Sigma-Aldrich	C-0250	to make 0.1 M Caco buffer
Super Glue	RS Components	918-6872	Cyanoacrylate glue, Step 1.3
TAAB 812 Resin	TAAB	T023	Epon ingredient
Tannic acid	TAAB	T046
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Two part Epoxy Resin	RS Components	132-605	Alternative: Step 2.13
Ultramicrotome	Leica	UC7
Vibrating microtome	Leica		100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .
Weldwood Original Contact cement	DAP	107	Contact adhesive: Step 3.1.4