クローン病における機械的ストレスの病原的役割を研究するためのTNBS誘発げっ歯類モデル
Summary
本プロトコールは、げっ歯類におけるクローン様大腸炎モデルの開発を記載している。経壁炎症はTNBS点眼部位に狭窄をもたらし、狭窄の近位セグメントに機械的拡大が観察される。これらの変化は、大腸炎における機械的ストレスの研究を可能にする。
Abstract
クローン病(CD)などの炎症性腸疾患(IBD)は、ヨーロッパおよび米国で約20 per 1,00,000に影響を及ぼす胃腸管の慢性炎症性障害である。CDは、経壁炎症、腸線維症、および管腔狭窄症を特徴とする。抗炎症療法は炎症の制御に役立つかもしれませんが、CDの線維症や狭窄には効果がありません。CDの病因はよく分かっていない。現在の研究は、主に調節不全の腸内免疫応答メカニズムの描写に焦点を当てている。CD関連経壁炎症、腸管線維症、および管腔狭窄症はすべて腸壁への機械的ストレスを表すが、CDにおける機械的ストレスの役割は明確に定義されていない。機械的ストレスがCDにおいて独立した病原性役割を果たすかどうかを決定するために、げっ歯類におけるTNBS誘発CD様大腸炎モデルのプロトコールが開発されている。このTNBS誘発性経壁炎症および線維症モデルは、結腸におけるCDの病理学的特徴に類似している。これは、成体スプレイグ・ドーリーラットの遠位結腸へのTNBSの結腸内点滴入によって誘導される。このモデルでは、経壁炎症はTNBS点眼部位(サイトI)で狭窄をもたらす。機械的膨張は、点眼部位に近い部分(部位P)において観察され、機械的ストレスを表すが目に見えない炎症を表す。炎症に対する遠位結腸部分(部位D)は、炎症も機械的ストレスも示さない。異なる部位(P、I、およびD)における遺伝子発現、免疫応答、線維症、および平滑筋成長の特徴的な変化が観察され、機械的ストレスの深刻な影響が浮き彫りになった。したがって、CD様大腸炎のこのモデルは、CDの病原メカニズム、特に免疫調節不全、腸線維症、およびCDにおける組織リモデリングにおける機械的ストレスおよび機械的ストレス誘発遺伝子発現の役割をよりよく理解するのに役立ちます。
Introduction
炎症性腸疾患(IBD)は、潰瘍性大腸炎(UC)およびクローン病(CD)を含む、胃腸(GI)管における慢性炎症によって特徴付けられる。それは〜100万〜200万人のアメリカ人に影響を与えます1。米国におけるIBDケアの推定年間費用は118億ドルです。UCとは異なり、CDは経壁炎症および狭窄形成によって特徴付けられる2,3。狭窄形成(狭窄)は、CD患者3の最大70%で起こり、経壁炎症(炎症性狭窄)または腸線維症(線維性狭窄)4,5によって引き起こされる可能性がある。腸管線維症は、プロセス3,4に関与する主な間葉系細胞型の1つとして平滑筋細胞(SMC)を有する過剰なコラーゲン沈着および他の細胞外マトリックス(ECM)によって特徴付けられる。肥大に関連する平滑筋過形成は、CD6における線維性狭窄症における別の重要な組織学的変化である。CDにおける狭窄形成は慢性炎症と関連しているが、外科的治療を除いて抗炎症治療は有効ではない2,6。しかし、術後の再発はほぼ100%であり、十分な時間が与えられている2,7。炎症反応として、線維症およびSMC過形成はまた、腸内の非炎症状態(すなわち、腸閉塞)において発症し得る8,9;炎症依存性および独立したメカニズムの両方が狭窄形成に関与していると考えられている3,4。炎症依存性機構に関する広範な研究が狭窄形成のためのいかなる効果的な治療法にも変換されていないことを考えると、腸線維症における炎症非依存性機構の可能な役割に関する研究が必要である。
非炎症性因子として、浮腫、炎症性細胞浸潤、組織変形、線維症、および狭窄10、11、12、13に関連する機械的ストレス(MS)は、IBD、特にCDにおいて一般的に遭遇し、これは経壁炎症によって特徴付けられる。機械的ストレスは狭窄性CDにおいて最も顕著であり、炎症部位における狭窄(炎症性または線維性)は局所組織に機械的ストレスを提示し、閉塞部位10,14に近位するセグメントにおける内腔膨張をもたらす。以前のインビトロ研究は、機械的ストレスが胃腸組織、特に腸平滑筋細胞(SMC)16における特定の炎症メディエーター(すなわち、COX-2、IL-6)8、14、15および成長因子(すなわちTGF-β)の遺伝子発現を変化させることを実証している16。最近の研究はまた、結合組織成長因子(CTGF)などの特異的な親線維性メディエーターの発現が機械的ストレスに対して非常に敏感であることも見出した17,18。機械的ストレスがCD関連炎症、線維症、および組織リモデリングにおいて独立した病原性役割を果たす可能性があるという仮説が立てられた。しかしながら、CDにおける腸の炎症、線維症、および平滑筋過形成における機械的ストレスの病原的意義は、ほとんど未解明のままである。これは、炎症が機械的ストレスよりも目に見え、よりよく研究されたプロセスであるためかもしれません。さらに重要なことに、機械的ストレスの影響と炎症の影響を区別するために、IBDの明確に定義された動物モデルはなかった。
今回の研究は、ハプテン試薬2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)19,20の結腸内注射によって誘発されるクローン様大腸炎のげっ歯類モデルを記述しており、CDにおける機械的ストレスの役割を研究する目的に役立つ可能性がある。TNBS点眼は、遠位結腸の内腔狭窄(狭窄)を伴う局在性(長さ〜2cm)の経壁炎症を誘発することが見出された。狭窄は顕著な腸膨張(機械的ストレス)14,15をもたらすが、点眼部位に近位の結腸セグメントでは目に見えない炎症をもたらす。それどころか、狭窄部位の遠位にある結腸セグメントは、炎症も機械的ストレスも示さない。遺伝子発現、炎症、線維症、およびSMC過形成における有意な部位特異的変化が、3つの異なる部位において観察された。この結果は、機械的ストレス、特に機械的ストレス誘発遺伝子発現が、クローン大腸炎における線維症および過形成の発症に重要な役割を果たす可能性があることを示唆している。
Protocol
Representative Results
Discussion
TNBS誘発性大腸炎は1989年に導入され、それ以来クローン病の実験モデルとして使用されてきました 19,20,23.げっ歯類におけるこのモデルの重要な特徴は、ヒトクローン病において発症した病理組織学的病変によく似た経壁炎症の発症を含む19,20。このモデルに関する以前の研究は?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NIH(R01 DK124611からXZSまで)と米国国防総省(W81XWH-20-1-0681からXZSまで)からの助成金によって部分的にサポートされています。組織学の研究は、UTMB外科病理学研究室の助けを借りて行われました。
Materials
| ACT-1 Control Software Ver2.63 | Nikon | DXM1200F | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BIO-RAD | 1851196 | |
| CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems | BIO-RAD | 1845097 | |
| Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer | Dako | AR310 | |
| Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 | Dako | AR173 | |
| DXM1200 Digital Color HR Camera | Nikon | DXM1200 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
| E-Z Anesthesia | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | BIO-RAD | HSP9601 | |
| HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) | CORNING | 21-021-CV | |
| HM 325 Microtome | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
| LI-COR Odyssey Digital Imaging System | LI-COR | 9120 | |
| Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler | Eppendorf | 5341 | |
| Medical grade open end polyurethane catheter | Covidien | 8890703013 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Nikon Eclipse E800 Upright Microscope | Nikon | E800 | |
| Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm | BIO-RAD | 1620215 | |
| Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative | Miralax | C8175 | Dose: 17g in 226 mL of water |
| RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers |
QIAGEN | 74106 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
| Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 | Sakura | 6190 | |
| Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer | Sakura | 6171 | |
| TNBS (Picrylsulfonic acid solution) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
Riferimenti
- Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn’s disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
- Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
- Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
- Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
- Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn’s disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
- Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn’s fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn’s and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
- Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn’s disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
- Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
- Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
- Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
- Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
- Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
- Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
- Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
- Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
- Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
- Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, 24 (2012).
- Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
- Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn’s colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
- Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
- Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
- Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
- Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
- Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).
