Den subretinala implantationen av retinalt pigmenterat epitel (RPE) är en av de mest lovande metoderna för behandling av degenerativa näthinnesjukdomar. Utförandet av prekliniska studier på storögda djurmodeller är dock fortfarande utmanande. Denna rapport presenterar riktlinjer för subretinal transplantation av RPE på en cellbärare till minigrisar.
Degenerativa störningar i näthinnan (inklusive åldersrelaterad makuladegeneration), som huvudsakligen har sitt ursprung vid eller inom det retinala pigmenterade epitelskiktet (RPE), leder till en progressiv disorganisering av näthinnans anatomi och försämringen av visuell funktion. Substitutionen av skadade RPE-celler (RPE) med in vitro-odlade RPE-celler med hjälp av en subretinal cellbärare har visat potential för att återupprätta den anatomiska strukturen hos de yttre näthinnelagren och studeras därför ytterligare. Här presenterar vi principerna för en kirurgisk teknik som möjliggör effektiv subretinal transplantation av en cellbärare med odlade RPE till minigrisar. Operationerna utfördes under generell anestesi och inkluderade en standard linssparande tre-port pars plana vitrektomi (PPV), subretinal applicering av en balanserad saltlösning (BSS), en 2,7 mm retinotomi, implantation av en nanofibrös cellbärare i subretinalutrymmet genom ytterligare 3,0 mm sklerotomi, vätske-luftutbyte (FAX), silikonoljetamponad och stängning av alla sklerotomier. Detta kirurgiska tillvägagångssätt användes i 29 operationer (18 djur) under de senaste 8 åren med en framgångsgrad på 93,1%. Anatomisk verifiering av den kirurgiska placeringen utfördes med hjälp av in vivo fundus-avbildning (fundusfotografering och optisk koherenstomografi). De rekommenderade kirurgiska stegen för subretinal implantation av RPE på en bärare i minigrisögon kan användas i framtida prekliniska studier med storögda djurmodeller.
Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) anses vara den främsta orsaken till central synförlust i utvecklade länder och är ett av många tillstånd relaterade till retinal pigmenterat epitel (RPE) dysfunktion 1,2. RPE finns på det basalt belägna Bruchs membran (BM) och ger det nödvändiga underhållet för fotoreceptorerna. Den progressiva degenerationen av RPE-skiktet är ett kännetecken för den tidiga atrofiska formen av AMD, och den åtföljer också utvecklingen av den sena exsudativa formen av AMD också. Trots många framsteg inom retinal sjukdomsbehandling är utvecklingen av en effektiv behandlingsmodalitet fortfarande utmanande3. En av de lovande metoderna är RPE-ersättning med hjälp av ett in vitro-odlat RPE-lager. Denna behandling är förknippad med framsteg inom stamcellsforskning med humant embryonalt stamcellshärlett RPE (hESC-RPE) och inducerat pluripotent stamcellshärlett RPE (iPSC-RPE)3,4,5,6,7. Under de senaste åren har många forskargrupper fokuserat på att utveckla olika metoder för RPE-ersättning med det ursprungligen accepterade proof-of-concept 8,9,10,11,12,13,14,15. RPE-cellerna (RPE) levereras vanligtvis in i subretinalutrymmet i form av en cellsuspension, ett självbärande cellark eller ett cellmonolager som stöds av en artificiell bärare 3,16,17,18,19,20,21. Injektion av en cellsuspension är den enklaste metoden, men BM: s komprometterade tillstånd kan ofta förhindra fästning av de transplanterade cellerna. Detta kan resultera i felaktig apicobasal orientering av RPE och misslyckande med att bilda ett monolager22,23. Den största fördelen med de andra två metoderna (dvs ett självbärande cellark och ett cellmonolager som stöds av ett konstgjort substrat) är att cellerna redan är i ett differentierat monolagertillstånd när de implanteras direkt i subretinalutrymmet24.
Många kirurgiska tekniker som beskriver leverans av cellbärare till subretinalutrymmet har publicerats de senaste åren 8,9,10,11,12,13,14,15. Dessa studier beskrev användningen av storögda djurmodeller, typerna av cellulära bärare, användningen av transplanterade cellulära kulturer, implantationsinstrumenten samt kirurgiska tekniker, och författarna fokuserade huvudsakligen på resultaten av subretinal implantation. År 2015 rapporterade Popelka et al. användningen av ett ramstött ultratunt elektrospunnet polymermembran för transplantation av RPE i svinkadaverögon8. Den kirurgiska tekniken som beskrivs här med subretinal implantation av cellbäraren möjliggjorde relativt exakt hantering av bäraren och enkel positionering av ställningen i subretinalutrymmet. Kozak et al. bedömde genomförbarheten av leveranstekniken hos en bärare med en ungefärlig storlek på 2 mm x 5 mm i svinögon9. Den unika utformningen av cellbäraren möjliggjorde korrekt placering, vilket förhindrade att det cellulära monolagret viks och skrynklas6. Al-Nawaiseh et al. presenterade först detaljerade steg-för-steg-riktlinjer för subretinal ställningsimplantation hos kaniner25. Stanzel et al. publicerade sedan ett liknande protokoll 2019 för transplantation hos små gnagare, kaniner, grisar och icke-mänskliga primater26. Som tidigare publicerats resulterade transplantationen av ett differentierat och polariserat RPE-monolager på en fast bärare i förbättrad överlevnad och bättre integration av transplantatet jämfört med andra leveranstekniker (kompletterande fil 1)27.
Syftet med alla prekliniska djurstudier som utförs in vivo är att avslöja de olika aspekterna av kirurgisk transvitreal subretinal implantation av en cellbärare med fokus på procedursäkerheten, överlevnaden av de transplanterade cellerna, vävnadssvaret på de subretinala manövrarna och de kort- och långsiktiga postoperativa resultaten. Användningen av svinögon som en storögd djurmodell har rapporterats vara relevant när det gäller omfattningen av de erhållna uppgifterna, vilket kan vara användbart och potentiellt tillämpligt på människor10,11,14. Vår studie rapporterar den kirurgiska tekniken som används för in vivo subretinal implantation av en cellbärare i en storögd djurmodell. Vi presenterar en detaljerad beskrivning av de preoperativa preparaten, den kirurgiska tekniken för implantation av subretinal cellbärare och den postoperativa vården av minigrisögonen baserat på vår erfarenhet under de senaste 8 åren. Vi beskriver de grundläggande kirurgiska principer som kan användas för in vivo experimentella studier som involverar implantation av olika typer av celler och cellbärare.
Stor djurmodell
Den experimentella besättningen av Liběchov minigrisar grundades genom att importera fem djur från Hormel-stammen från USA 1967. Dessa djur korsades för svinblodgruppsstudier med flera andra raser eller stammar: Landrace, Large White, Cornwall, vietnamesiska grisar och miniatyrgrisar av Göttingen-ursprung28,29. Vid 5 månaders ålder och cirka 20 kg kroppsvikt (BW) når minigrisarna sexuell mognad. Överlevnaden av föräldrarnas minigrisraser (Hormel och Göttingen) rapporteras vara 12-20 år. Den subretinala implantationen av cellbäraren riktar sig mot den centrala delen av näthinnan. Minisvinens näthinna saknar en makula och fovea. Det har emellertid regioner med högkonade konfotoreceptorer som kallas området centralis och visuella streck30,31. Dessa regioner ansvarar för högsta synskärpa.
Operationerna utfördes av fyra erfarna vitreoretinala kirurger med hjälp av en erfaren kirurgisk anläggningsassistent (TA). Före in vivo-experimenten utbildades kirurgerna och fick särskild kunskap om minipigögonanatomi, såsom avseende det lägre förhållandet mellan lins och glaskroppsvolym, den kortare axiella längden (15-19 mm), frånvaron av Bowmans membran i hornhinnan, den mindre glaskroppen (2,8-3,2 ml), frånvaron av makula och fovea, frånvaron av ringformen av Zinn och den optiska skivans diameter (vertikal/horisontell: 1,5 mm/2,1 mm). I samtliga fall utfördes operationen under generell anestesi i ett speciellt organiserat operationsrum med genomförande av standard aseptiska och antiseptiska åtgärder.
Subretinal implantation av RPE-celler med olika ursprung är en mycket lovande trend inom ögonforskning för behandling av retinala degenerativa störningar, såsom AMD 3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,25 . Huvudidén med detta tillvägagångssätt är att ersätta de skadade RPE: erna med friska RPE odlade ex vivo (kompletterande fil 1) 44,45,46,47,48. Användningen av cellbärare för att transplantera de odlade RPE-cellerna representerar det mest rimliga tillvägagångssättet, eftersom de porösa membranen håller det polariserade RPE-cellskiktet i rätt orientering med avseende på det fotosensoriska skiktet.
Optimal djurmodell
Ett kritiskt steg i utvecklingen av sådana behandlingsmetoder är användningen av den optimala djurmodellen49. Tidigare har små och stora djurmodeller använts, inklusive kaniner, hundar, grisar och icke-mänskliga primater 8,9,10,11,12,13,14,15,27,29. I denna uppsats föreslår vi användning av Liběchov minipig-modellen och beskriver de preoperativa, kirurgiska och postoperativa stegen som möjliggör robusta transplantationseffektiviteter. Minigrisen Liběchov föddes ursprungligen för cirka 20 år sedan och har ofta använts inom biomedicinsk forskning inom neurodegenerativa sjukdomar, såsom Parkinsons och Huntingtons sjukdom29,50. Eftersom grisen har en relativt stor hjärna med en blodtillförsel och immunologiskt svar som liknar dem hos människor, har den använts som djurmodell för allogen transplantationsexperiment samt51,52,53,54. Även om minigrisens näthinna inte har en människoliknande makula och fovea, innehåller den området centralis och visuella streck, som är regioner i näthinnan med en hög koncentration av konfotoreceptorer30. Den liknande storleken på det mänskliga ögat, närvaron av en konberikad central näthinna, det väl beskrivna immunsystemet och förekomsten av metoder för att bedöma morfologi och funktion efter operationen är viktiga argument för användningen av denna stora djurmodell i den presenterade studien.
Kirurgiskt ingrepp
Så vitt vi vet finns det inga standardiserade och allmänt accepterade kirurgiska tekniker för vitreoretinal transplantation av RPE-celler på bärare. En av de viktigaste frågorna med cellersättningsterapi är den utmanande kirurgiska tekniken som har risk för intraoperativa och postoperativa komplikationer kopplade till näthinneavlossning, hypotoni, episkleral, koroidal och / eller retinal blödning och hög intraokulär turbulens, vilket kan leda till ställningsskador. Postoperativt finns det risk för proliferativ vitreoretinopati, endoftalmit, hypotoni, näthinneavlossning och kataraktbildning 4,10,13,14,15.
De första studierna på tillvägagångssätt med cellbärare utfördes på chinchilla bastard kaniner13,16,25. Även om dessa djur representerar en smådjursmodell var resultaten med fokus på de tekniska aspekterna av operationen avgörande för utvecklingen av procedurerna i stora djurmodeller och sammanfattas därför nedan.
En skräddarsydd 23 G infusionskanyl användes ursprungligen med två sidoportar för att omdirigera jetströmmen, vilket hjälpte till att lösa kollapsen av bleb och därmed näthinneavlossning13. I den aktuella studien märkte vi inte någon sådan kollaps av bleb. Den möjliga orsaken till det kan vara ögonglobens större storlek och prestandan hos kärnvitrektomi med sparat glaskropp i periferin vid kanylinfusionsstället, vilket kan minska kraften hos den riktade jetströmmen.
Svårigheter under utstötningen av cellbäraren från instrumentet var ett annat intraoperativt hinder i smådjursmodellerna, som kategoriserades som “fångade med instrumentet”. Dessutom föreslog författarna att resterande glaskropp på näthinnans yta kan orsaka ett bakåt “hopp” av bäraren ur retinotomiöppningen efter implantation. Detta problem kan lösas med en enzymassisterad vitrektomi, vilket möjliggör en jämn, kontinuerlig utstötning av cellbäraren i subretinalutrymmet. I de flesta fall flyttade författarna bäraren för att få en mer avlägsen plats för implantatet bort från retinotomi. I vår fallserie upplevde vi också en situation där cellbäraren förblev fäst vid injektorns spets. Det hanterades dock genom långsam och mild manipulation av ljusröret och injektorns spets. Vi observerade inte någon kvarvarande glaskropp på platsen för retinotomi i något av våra fall. Användningen av TA-assisterad PPV vid operationerna kan föreslås som en metod för att minska risken för kvarvarande glaskropp. Flera färgningar med TA kan vara nödvändiga för att helt avlägsna det överliggande glaskroppen.
I en annan studie rapporterades resultaten av subretinal implantation av humana RPE-stamceller odlade som ett polariserat cellulärt monolager på ett polyestermembran24. Under experimenten användes samma kirurgiska teknik som beskrivitstidigare 13, men en två-port PPV-metod tillämpades. Slutligen publicerades ett steg-för-steg-protokoll för subretinal implantation av cellbärarkirurgi hos kaniner senare25. Denna studie presenterar en mycket detaljerad och lätt repeterbar beskrivning av det kirurgiska ingreppet, inklusive preoperativ och postoperativ vård, som också bygger på tidigare erfarenheter.
Vid användning av stordjursmodeller i efterföljande studier behandlades inte bara tekniska frågor utan även frågor om immunreaktionen mot de transplanterade cellerna, samt cellbärarstorleksrelaterade frågor. En studie med cynomolgusapor (Macaca fascicularis) beskrev resultaten av subretinal implantation av humana stamcellshärledda RPE-monolager15. Alla djuren genomgick systemisk immunsuppression, som bestod av sirolimus (laddningsdos på 2 mg, daglig dos på 1 mg) och tetracyklin (7,5 mg/kg– kroppsvikt) med start 7 dagar före operationen och 3 månader efter operationen. Det kirurgiska ingreppet utfördes enligt protokoll som beskrivits tidigare24,25. Författarna använde en 25 G tre-port PPV-strategi med ljuskrona endo-belysning. Viktigt är att en TA-assisterad PVD användes för att utesluta kvarvarande vitreoretinal vidhäftning på den bakre näthinnan. Som ett tillägg till den ursprungligen beskrivna proceduren tog författarna bort värd-RPE-skiktet i området för framtida implantation med hjälp av ett 20 G skräddarsytt utdragbart loopinstrument.
I vår minipig-studie använde vi också systemisk immunsuppression. Emellertid skilde sig typen av immunsuppression från den som beskrivits ovan. Vi administrerade en subkutan injektion av takrolimuseluerande polymermikrosfärer som en depå i en dos av 0,25 mg/kg kroppsvikt för att hämma celltransplantatavstötning och inflammatoriska reaktioner. Vi tog inte bort värd-RPE-cellskiktet under operationen, eftersom vårt primära mål var att analysera procedurens säkerhet och livskraften hos de implanterade cellerna men inte deras integration i värdnäthinnan.
Tidigare utvärderades säkerheten och genomförbarheten av subretinal implantation av ett monolager av hESC-härledda RPE på ett vikbart icke-nedbrytbart mesh-stött submikronparylen-C-membran (6,25 mm x 3,5 mm, 0,4 μm tjockt) hos 14 kvinnliga Yucatán-minigrisar10. Efter odling såddes cellerna på ett nätstött membran. Immunsuppression utfördes med systemisk administrering av takrolimus (ingen regim och dos indikerad) och intravitreala injektioner av 0,7 mg dexametasonimplantat vid slutet av operationen. PPV utfördes med en 20 G-strategi. Författarna använde en intravitreal injektion av triamcinolonacetonid för bättre visualisering av glaskroppen. Den stora sklerotomin var 2 mm till 3 mm stor. Efter subretinalinjektionen plattades näthinnan med en tillfällig injektion av perfluorkarbonvätska. Efter utbytet mellan vätska och luft utfördes en silikonoljetamponad (1 000/5 000 cSt). Postoperativ vård inkluderade okulär applicering av dexametason/neomycin/polymyxin B salva 1 vecka efter operationen. Författarna rapporterade en framgångsgrad på 91% (dvs. effektiv subretinal implantation och tillräcklig postoperativ bilddata). I vår studie användes intravitreal injektion av TA-kristaller intraoperativt och främst för att visualisera glaskroppen. Den lokala immunsuppressiva effekten av detta läkemedel är emellertid fortfarande oklar. De nanofibrösa cellbärarna som användes i vår studie var 5,2 mm x 2,1 mm och 3,7 μm tjocka, med porstorlekar på 0,4 μm. Under operationen utförde vi direkt FAX istället för att injicera perfluorkarbonvätska. Vår kirurgiska framgångsgrad (93,1%) överensstämde med och var något bättre än Koss et al.10.
Subretinal transplantation av helt nedbrytbara cellbärare (byggnadsställning) för subretinal implantation studerades först 2019 i Yorkshire grisar14. Studien var huvudsakligen inriktad på de biologiskt nedbrytbara egenskaperna hos fibrinhydrogelimplantat. Författarna noterade att den aggressiva immunsuppressionen som används på tamsvin kan hämma en lokal inflammatorisk reaktion som potentiellt orsakas under biologisk nedbrytning av fibrinhydrogelimplantaten. De specificerade dock inte den immunsuppressiva behandlingen som användes hos grisarna. Under PPV utförde de en 3,6 mm lång sklerotomi för införande av den subretinala implantationsanordningen parallellt med och cirka 3,5 mm bakom limbus. Dessutom använde de ett pneumatiskt drivet injektionssystem som syftade till att minska handplaceringsinstabiliteten orsakad av fingermanipulation. I vår fallserie var alla sklerotomier 2,5 mm till 3,0 mm från limbus. Den stora sklerotomin för införandet av injektorn var 3 mm lång. Implantationsinjektorn som användes i vår studie opererades för hand. Grundlig cautery av pars plana i ciliärkroppen och ett tillräckligt snitt inuti den stora sklerotomin verkar vara avgörande för att undvika intraoperativa komplikationer såsom iatrogen perifer retinalavskiljning, blödning och förlust av implantatet.
Sammanfattningsvis beskriver vi användningen av Liběchov minipig-modellen för transplantation av RPE-celler på biologiskt nedbrytbara bärare som ett behandlingsalternativ för ärftliga och förvärvade näthinnesjukdomar. Likheter i ögonanatomi och fysiologi, liksom med avseende på immunsystemet, tillåter oss att utveckla och förbättra kirurgiska tekniker och instrument för subretinal implantation av celler, som lätt kan överföras till behandling av mänskliga ögonsjukdomar. Det är viktigt att säkerställa att operationer på minigrisar utförs med samma instrument (inklusive implantationsleveransverktyg) när de används vid mänskliga operationer, vilket underlättar tillämpningen av vunnen erfarenhet och kunskap på människor. Alternativa storögda djurmodeller med närvaro av ett makulärt område, såsom icke-mänskliga primater, kan vara användbara för uppföljning och analys av de anatomiska och funktionella förändringarna efter subretinal implantation i det centrala retinala området. Den detaljerade beskrivningen av preoperativa, kirurgiska och postoperativa vårdprocedurer kommer att vara användbar för framtida studier genom att öka effektiv och standardiserad datagenerering.
The authors have nothing to disclose.
Projektet stöddes av The Czech Science Foundation (projektnummer 18-04393S) och Norway Grants and Technology Agency of the Czech Republic (KAPPA Programme, projektnummer TO01000107).
Technical equipment | |||
Wato EX-65 with a Mindray iMEC10 | Mindray, Shenzhen, China | Wato Ex-65 | anesthesia machine |
R-Evolution CR | Optikon, Rome, Italy | R-Evolution CR | phacoemulsifier/vitrectome |
Green laser Merilas 532α | Meridian, Thun, Switzerland | Merilas 532α | ophthalmic green laser |
Microscope Hi-R NEO 900A | Haag-Streit Surgical, Wedel, Germany) | Hi-R NEO 900A | ophthalmic surgery microscope |
Camera Sony PMW-10MD | Sony, Tokyo, Japan | PMW-10MD | full HD medical 2-piece |
Non-contact vitreoretinal surgical system MERLIN BIOM | Volk, Mentor, OH, USA | MERLIN BIOM | BIOM |
Steam sterilizer | Tuttnauer Europe B.V., Breda, NL | 3870 HSG | sterilizer |
iCam100 | Optovue, Fremont, CA, USA | iCAM100 | funduscamera |
iVue OCT100-2 | Optovue, Fremont, CA, USA | iVue OCT100-2 | OCT |
Microsurgical instruments and devices | |||
Cook Eye Speculum | Katena, New Jersey, US | K1-5403 | 15mm blades |
Ophthalmology surgical drape | Hylyard, Alpharetta, Georgie, USA | 79304 | 132 x 142cm |
Disposable Two step vitrectomy system. (23 gauge/ 0.6 mm) | DORC, Zuidland, Netherlands | 1272.ED06 | |
Infusion line for 23G / 0.6 mm infusion cannula | DORC, Zuidland, Netherlands | 1279.P | |
knife 2.75mm, IQ Geometry Tm Slit Knife Angled, Bevel Up | Surgical Specialties Corporation, Reading, USA | 72-2761G | |
Extendible 41G subretinal injection needle. (23 gauge / 0.6 mm) | DORC, Zuidland, Netherlands | 1270.EXT | |
Omnifix 3ml Luer Lock Solo siringe | BBraun, Melsungen, Germany | 4617022V | 3ml |
1ml soft-inject Tuberculin | Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany | 5010.200V0 | 1ml |
8-0 Coated Vicryl | Ethicon, Puerto Rico, USA | J409G | |
Purified Silicone Oil (in syringe) 10 ml | (FCI, Paris, France) | S5.7170 | 1000cSt |
Pinnacle 360 Morris Vertical Scissors 23Ga | Synergetics, O'Fallon, USA | 10.24.23PIN | 23Ga |
Revolution DSP 23Ga ILM forceps | Alcon, Geneva, Switzerland | 706.44 | Griesharber revolution |
23ga Straight Laser Probe | Synergetics, O’Fallon, USA | 55.21.23 | |
FCI Protect 2.0% | FCI Ophthalmics, Paris, France | S5.9100 | viscoelastic |
DK Westcott style Stitch Scissors, Curve | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 1-501 | Curve |
Pierse Notched Forceps, 0,3mm Straigh | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 2-100-1E | 0,3mm straigh |
DK Harms-Tubingen Straight Tying Forceps | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 2-504E | 6mm |
DK Needle Holder, Straigh | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 3-201 | 9mm straigh |
Medications and solutions | |||
Unitropic 1% gtt. | UNIMED PHARMA spol. s r.o., Bratislava, Slovak republic | tropicamidum 10 mg/ml | eye drops |
Diprophos | Merck Sharp & Dohme B.V., Haarlem, Netherlands | betamethasonum 7 mg/ml | 1ml |
Alcon BSS Irrigation Solution | Alcon, Geneva, Switzerland | balance salt solution (BSS) | 500ml |
Betaisodona | Mundipharma, Cambridge, United Kingdom | povidon-Iodine 1g/10ml | 30ml |
Depo-medrol 120mg | Pfizer, New Yourk, USA | methylprednisolon | 5ml/200mg |
Shotapen | Virbac Carros Cedex, France | benzylpenicillin, dihydrostreptomycin | 250ml |
Flunixin a.u.v. | Norbrook, Newry, Northern Ireland | flunixinum 50,0 mg | 250ml |
Tramal 100MG/2ML | Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland | tramadol | 2ml |
Zoletil 100 | Virbac Carros Cedex, France | tiletamine, zolazepam | 100mg |
Narkeran 10 | Vetoquinol, Magny-Vernois, France | ketamin | 2ml |
Rometar 20mg/ml | Spofa pharmaceutica, Prague, Czech republic | xylazinum | 20mg |
Braunol 75mg/g | B.Braun medical, Prague, Czech republic | povidone iodine | 75mg/g |
Propofol 1% MCT/LCT | Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland | propofol | 10mg/1ml |
Isoflurane 100% Inhalation vapour, liquid | Piramal Critical Care Limited, West Drayton, United Kingdom | isoflurane | 100% |
Benoxi gtt. 4mg/1ml | Unimed pharma, Bratislava, Slovakia | oxybuprakaine | 10ml |
Neosynephrin POS 10% gtt. | Ursapharm , Saarbrücken, Deutschland | fenylefrin chloride | 10ml |
Ophthalmo-framykoin 1X5GM | Zentiva a.s., Prague, Czech republic | bacitracin zinc/hydrocortisone acetate/hydrocortisoneacetate/neomycin sulfate | 5mg |
Floxal ung. | Dr. Gerhard Mann Chem.-Pharm. Fabrik, Berlin, Germany | ofloxacin | 0.30% |
Eficur inj. | Hipra, Amer, Spain | ceftiofurum hydrochloridum | 50mg / 1ml |
Draxxin | Zoetis Inc., New Jersey, USA | tulathromycinum | 100mg / 1ml |
Tramal | Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland | tramadoli hydrochloridum | 100mg / 2ml |
Xylapan | Vetoquinol, Magny-Vernois, France | xylazinum | 0.4 mg/kg |
Proparacaine hydrochlorid ophthalmic solution 0,5% | Bausch&Lomb Incorporated Tampa, FL, USA | Proparacaine hydrochlorid | 0.50% |
Prograf | Astellas Pharma, Deerfield, Illinois, USA | Tacrolimus powder | 1mg |
Cell carrier, cultivated cells cultures, and implantation injector | |||
Falcon Cell Culture Inserts | Corning Inc., Kenneburg, ME, USA | 353103 | |
TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 12604021 | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 11320033 | |
Biolaminin 521 LN (LN521) | BioLamina, Sundbyberg, Sweden | LN521-02 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 35050061 | |
2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | J66742.0B | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, San Luis, Mi, USA | P4333 | |
CRALBP | Novus Biologicals, Abingdon, UK | NB100-74392 | |
Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Germany | 21202 |