يصف هذا البروتوكول طريقة لتتبع تطور مرض الذئبة في الفئران. يتم تقديم إجراءين إضافيين لتوصيف التهاب الكلية الذئبي بناء على تسلل الخلايا وترسب البروتين في الكلى.
الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) هي اضطراب مناعي ذاتي بدون علاج معروف ويتميز بالتهاب مستمر في العديد من الأعضاء ، بما في ذلك الكلى. في ظل هذه الظروف ، تفقد الكلى قدرتها على تنظيف النفايات من الدم وتنظيم تركيزات الملح والسوائل ، مما يؤدي في النهاية إلى الفشل الكلوي. يتم تشخيص النساء ، وخاصة النساء في سن الإنجاب ، تسع مرات أكثر من الرجال. أمراض الكلى هي السبب الرئيسي للوفيات في مرضى الذئبة الحمراء. يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة وبسيطة لقياس مستويات البروتين المفرزة في البول الذي تم جمعه ، وتتبع تطور مرض الذئبة بمرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير نهج لعزل خلايا الكلى أحادية النواة بناء على اختيار الحجم والكثافة للتحقيق في التسلل الكلوي للكريات البيضاء. علاوة على ذلك ، تم تطوير طريقة كيميائية نسيجية مناعية لتوصيف ترسب البروتين في الكبيبات وتسلل الكريات البيض في الفضاء الأنبوبي الخلالي. معا ، يمكن أن تساعد هذه الطرق في التحقيق في تطور الالتهاب المزمن المرتبط بكلى الفئران المعرضة للذئبة MRL / lpr.
الوظيفة الأساسية للكلية هي القضاء على المواد السامة عن طريق البول مع الحفاظ على توازن الماء والأملاح1. هذه الوظيفة مهددة في المرضى الذين يعانون من الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) ، مما يؤدي إلى ما يسمى التهاب الكلية الذئبة (LN). LN هو نتيجة لمهاجمة الجهاز المناعي للكلى ، مما يؤدي إلى التهاب الكلى المستمر ، وبالتالي فقدان قدرته على تنظيف النفايات من الدم وتنظيم تركيزات الملح والسوائل. هذا سيؤدي في النهاية إلى الفشل الكلوي ، والذي يمكن أن يكون قاتلا. أثناء العملية الكلوية ، يتم تجنيد الخلايا البائية المتداولة والخلايا التائية والخلايا الوحيدة في الكلى ، وإفراز الكيموكينات والسيتوكينات والأجسام المضادة الذاتية المكونة للمجمع المناعي. هذا يؤدي في نهاية المطاف إلى تلف الخلايا البطانية ، والإصابات الغشائية ، وضمور أنبوبي كلوي ، وتليف2.
MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) الفئران المعرضة للذئبة هي نموذج فأر كلاسيكي يظهر علامات سريرية تشبه الذئبة تشبه SLE3 البشري. كان لهذا النموذج دور فعال في فهم أحد الأسباب الرئيسية للوفيات لدى مرضى الذئبة الحمراء ، التهاب الكلية الذئبي (LN)4. في كل من الذئبة الحمراء البشرية والفأرية ، يتميز LN بالتهاب تدريجي ناتج عن ترسب كلوي للمجمعات المناعية ، يليه تنشيط مكمل ، وتجنيد الخلايا الالتهابية ، وفقدان وظائف الكلى5. ترسب المركب المناعي هو الخطوة الأولى للحث على إنتاج الكيموكين والسيتوكين بواسطة الخلايا الكلوية الجوهرية ، مما يوسع الاستجابة الالتهابية عن طريق تجنيد الخلايا المناعية6. يقدم البروتوكول الحالي العديد من التقنيات لمتابعة تطور أمراض الكلى التي تحلل تسلل الخلايا والترسب المعقد المناعي.
يسمح البول الذي يتم جمعه كل أسبوع بالكشف عن الدورة الزمنية للبيلة البروتينية وتصورها قبل وأثناء وبعد ظهور مرض الذئبة. يمكن للبيلة البروتينية كعلامة حيوية تحديد التقدم البيولوجي ل LN. المزايا الأخرى لهذه التقنية هي أنها غير غازية وفعالة من حيث التكلفة وسهلة التنفيذ7. عندما تعمل الكلى بشكل مثالي ، يكون مستوى البيلة البروتينية منخفضا باستمرار. ومع ذلك ، في الفئران MRL / lpr ، بعد 8-9 أسابيع من العمر ، لوحظ زيادة تدريجية في مستوى البيلة البروتينية ، والتي هي في نهاية المطاف عالية بما يكفي للتسبب في الفشل الكلوي8. تتوفر شرائط كاشف متعددة وكواشف قياس الألوان تجاريا لمراقبة المشكلة. ومع ذلك ، فإن فحص برادفورد رخيص ودقيق للغاية في تحديد بداية البيلة البروتينية ومسار التهاب الكلية الذئبي. هذا الفحص سريع ، ولا يتأثر الكاشف بوجود المذيبات والمخازن المؤقتة وعوامل الاختزال وعوامل تخلب المعادن التي قد تكون في عينتك9،10،11.
أحد الجوانب المهمة التي يجب مراعاتها هو تسلل الخلايا في الكلى. هذه التسلل تعزز التسبب في المرض عن طريق تحفيز إفراز العوامل القابلة للذوبان مثل السيتوكينات لتفاقم الالتهاب12. لفهم أفضل لمجموعات الخلايا الموجودة في التسلل ، فإن الطريقة المفيدة هي عزل الكريات البيض13. هنا ، يتم استخدام الكشف عن التسلل الكلوي للخلايا البائية كمثال. يبدأ الإجراء بعملية هضم مع ديوكسي ريبونوكلياز (DNase) والكولاجيناز ، يليه فصل تدرج الكثافة الذي يزيل الحطام وخلايا الدم الحمراء والخلايا المحببة الكثيفة. سبب عزل الخلايا البائية (CD19+) وخلايا البلازما (CD138+) هو أن الكلى الذئبية يمكن أن تركز هذه الخلايا14. يقترح أن وجود الخلايا البائية في مجاميع صغيرة في الكلى يمكن أن يشير إلى التوسع النسيلي ، وبالتالي إنتاج الغلوبولين المناعي (Ig). من المعروف أن خلايا البلازما موجودة في هذه المجاميع بالإضافة إلى15. بمجرد عزل الكريات البيض ، يمكن استخدام فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) لتحليل الخلايا ذات الأهمية عند تلطيخ الأجسام المضادة المختلفة المترافقة مع التألق.
التألق المناعي هو أحد طرق الكشف عن الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) التي تسمح بالتصور الفلوري للبروتينات في عينات أنسجة الكلى السميكة 4 ميكرومتر. تعتمد طرق الكشف الأخرى عن المدينة العالمية للخدمات الإنسانية على طبيعة التحليلات وكيمياء الربط وعوامل أخرى16. التألق المناعي هو طريقة تحديد سريعة تعرض المستضد لنظيره من الأجسام المضادة الموسومة بفلوروكروم معين (أو صبغة فلورسنت). عندما يكون متحمسا ، فإنه ينتج ضوءا يمكن أن يكتشفه المجهر الفلوري. يمكن استخدام هذه التقنية لمراقبة ترسب المكمل C3 و IgG2a17. يمكن أن يرتبط التنشيط المفرط للتسلسل التكميلي باستجابة مناعية غير منضبطة وفقدان الوظيفة18. يعد الترسب المناعي للأجسام المضادة للحمض النووي المزدوج (anti-dsDNA) في الكلى مصدر قلق كبير19 ، حيث ارتبط أولئك الذين لديهم النمط المتماثل IgG2a ب LN20. على وجه التحديد ، تظهر الأجسام المضادة المضادة ل dsDNA المزيد من الإمراض والتقارب مع المواد النووية ، وتشكل مجمعات مناعية21. عندما يكون IgG2a موجودا ، يتم تنشيط سلسلة المكمل ، بما في ذلك C3 ، لإزالة المجمعات المناعية22. يمكن تحديد علامات C3 و IgG2a كميا بشكل فردي أو تراكبها لإنشاء ارتباطها.
والجدير بالذكر أن قياس الكرياتينين في الدم هو تقنية أخرى موثوقة يمكن استخدامها مع بيلة دموية مجهرية وخزعات الكلى لتشخيص LN23. ومع ذلك ، فإن وجود البيلة البروتينية هو مؤشر قوي على تلف الكبيبات. وبهذا المعنى ، فإن مراقبة مستوى البيلة البروتينية أثناء مرض الذئبة يمكن أن تكشف عن بداية المرض وتكمل الطرق الأخرى لتشخيص مرض الذئبة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمجمعات المناعية المودعة في الكبيبات أن تحفز استجابة التهابية ، وتنشط نظام التكملة ، وتجند المزيد من الخلايا الالتهابية. نقطة أخرى جديرة بالملاحظة في هذا البروتوكول هي تسلل الخلايا البائية في الكلى. هذا ، جنبا إلى جنب مع الخلايا التائية المخترقة ، يضخم الاستجابات المناعية المحلية التي تؤدي إلى تلف الأعضاء. الأهم من ذلك ، أن تصنيف LN لا يعتمد فقط على التغيرات المورفولوجية الكبيبية التي شوهدت في الفحص المجهري ولكن أيضا على الرواسب المناعية التي لوحظت مع التألق المناعي. لذلك ، في هذا البروتوكول ، يتم تقديم طرق دقيقة وفعالة من حيث التكلفة لتحليل وظائف الكلى في إعدادات المختبر.
LN هو السبب الرئيسي للوفيات في مرضى الذئبة الحمراء ، ولا تزال العوامل التي تؤدي إلى تفاقم المرض غير واضحة. تطبيق هذا البروتوكول هو توصيف وظائف الكلى باستخدام طرق متعددة ، بما في ذلك قياس البيلة البروتينية ، وتحليل FACS لكريات الدم البيضاء المعزولة في الكلى ، وتلطيخ التألق المناعي لأقسام الكل…
The authors have nothing to disclose.
نشكر المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي ، ومختبر علم الأنسجة المرضي ، ومركز فرالين للتصوير في معهد فرجينيا للفنون التطبيقية ، وجامعة الولاية على الدعم الفني. يتم دعم هذا العمل من خلال العديد من المعاهد الوطنية للصحة والمنح الداخلية.
10x Tris-Buffered Saline (TBS) | Thermo Fisher Scientific | J60764.K2 | |
2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
Anti-Human/Mouse C3 | Cedarlane | CL7632F | |
Anti-Mouse CD138 BV711 | Biolegend | 142519 | |
Anti-Mouse CD45 AF700 | Biolegend | 103127 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
Collagenase D | Sigma-Aldrich | 11088882001 | |
Confocal Microscope LSM 880 | Zeiss | LSM 880 | |
Coplin jar | Fisher Scientific | 50-212-281 | |
Cryomold | Fisher Scientific | NC9511236 | |
Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Percoll |
DEPC-Treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9906 | |
DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
dsDNA-EC | InvivoGen | tlrl-ecdna | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid | Fisher Scientific | S311-500 | EDTA |
EVOS M5000 Microscope imaging system | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | |
FACS Fusion Cell sorter | BD Biosciences | FACS Fusion | |
Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated | R&D systems | S11150H | |
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
Graphpad prism | GraphPad | N/A | |
Hank’s Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-079 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
ImageJ software | National Institutes of Health | N/A | |
Lactobacillus reuteri Kandler et al. | ATCC | 23272 | |
MEM non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) | Jackson Lab | 485 | |
Nail enamel | N/A | N/A | Any conventional store |
O.C.T compound | Tisse-Tek | 4583 | |
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Polysciences | R-30 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 70011069 | |
Pierce 20x TBS Buffer | Thermo Fisher Scientific | 28358 | |
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23236 | Albumin standard included |
ProLon Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553141 | FcR block |
RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
SpectraMax M5 | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.1 software |
Sterile cell Strainers 100 µM | Fisher Scientific | 22363549 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Vancomycin Hydrochloride | Goldbio | V-200-1 | |
Zombie Aqua | Biolegend | 423102 | fluorescent dye for flow cytometry analysis |