Summary

تحليل البيلة البروتينية ، والتسلل الكلوي للكريات البيضاء ، والترسب الكلوي للبروتينات في الفئران المعرضة للذئبة MRL / lpr

Published: June 08, 2022
doi:

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة لتتبع تطور مرض الذئبة في الفئران. يتم تقديم إجراءين إضافيين لتوصيف التهاب الكلية الذئبي بناء على تسلل الخلايا وترسب البروتين في الكلى.

Abstract

الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) هي اضطراب مناعي ذاتي بدون علاج معروف ويتميز بالتهاب مستمر في العديد من الأعضاء ، بما في ذلك الكلى. في ظل هذه الظروف ، تفقد الكلى قدرتها على تنظيف النفايات من الدم وتنظيم تركيزات الملح والسوائل ، مما يؤدي في النهاية إلى الفشل الكلوي. يتم تشخيص النساء ، وخاصة النساء في سن الإنجاب ، تسع مرات أكثر من الرجال. أمراض الكلى هي السبب الرئيسي للوفيات في مرضى الذئبة الحمراء. يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة وبسيطة لقياس مستويات البروتين المفرزة في البول الذي تم جمعه ، وتتبع تطور مرض الذئبة بمرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير نهج لعزل خلايا الكلى أحادية النواة بناء على اختيار الحجم والكثافة للتحقيق في التسلل الكلوي للكريات البيضاء. علاوة على ذلك ، تم تطوير طريقة كيميائية نسيجية مناعية لتوصيف ترسب البروتين في الكبيبات وتسلل الكريات البيض في الفضاء الأنبوبي الخلالي. معا ، يمكن أن تساعد هذه الطرق في التحقيق في تطور الالتهاب المزمن المرتبط بكلى الفئران المعرضة للذئبة MRL / lpr.

Introduction

الوظيفة الأساسية للكلية هي القضاء على المواد السامة عن طريق البول مع الحفاظ على توازن الماء والأملاح1. هذه الوظيفة مهددة في المرضى الذين يعانون من الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) ، مما يؤدي إلى ما يسمى التهاب الكلية الذئبة (LN). LN هو نتيجة لمهاجمة الجهاز المناعي للكلى ، مما يؤدي إلى التهاب الكلى المستمر ، وبالتالي فقدان قدرته على تنظيف النفايات من الدم وتنظيم تركيزات الملح والسوائل. هذا سيؤدي في النهاية إلى الفشل الكلوي ، والذي يمكن أن يكون قاتلا. أثناء العملية الكلوية ، يتم تجنيد الخلايا البائية المتداولة والخلايا التائية والخلايا الوحيدة في الكلى ، وإفراز الكيموكينات والسيتوكينات والأجسام المضادة الذاتية المكونة للمجمع المناعي. هذا يؤدي في نهاية المطاف إلى تلف الخلايا البطانية ، والإصابات الغشائية ، وضمور أنبوبي كلوي ، وتليف2.

MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) الفئران المعرضة للذئبة هي نموذج فأر كلاسيكي يظهر علامات سريرية تشبه الذئبة تشبه SLE3 البشري. كان لهذا النموذج دور فعال في فهم أحد الأسباب الرئيسية للوفيات لدى مرضى الذئبة الحمراء ، التهاب الكلية الذئبي (LN)4. في كل من الذئبة الحمراء البشرية والفأرية ، يتميز LN بالتهاب تدريجي ناتج عن ترسب كلوي للمجمعات المناعية ، يليه تنشيط مكمل ، وتجنيد الخلايا الالتهابية ، وفقدان وظائف الكلى5. ترسب المركب المناعي هو الخطوة الأولى للحث على إنتاج الكيموكين والسيتوكين بواسطة الخلايا الكلوية الجوهرية ، مما يوسع الاستجابة الالتهابية عن طريق تجنيد الخلايا المناعية6. يقدم البروتوكول الحالي العديد من التقنيات لمتابعة تطور أمراض الكلى التي تحلل تسلل الخلايا والترسب المعقد المناعي.

يسمح البول الذي يتم جمعه كل أسبوع بالكشف عن الدورة الزمنية للبيلة البروتينية وتصورها قبل وأثناء وبعد ظهور مرض الذئبة. يمكن للبيلة البروتينية كعلامة حيوية تحديد التقدم البيولوجي ل LN. المزايا الأخرى لهذه التقنية هي أنها غير غازية وفعالة من حيث التكلفة وسهلة التنفيذ7. عندما تعمل الكلى بشكل مثالي ، يكون مستوى البيلة البروتينية منخفضا باستمرار. ومع ذلك ، في الفئران MRL / lpr ، بعد 8-9 أسابيع من العمر ، لوحظ زيادة تدريجية في مستوى البيلة البروتينية ، والتي هي في نهاية المطاف عالية بما يكفي للتسبب في الفشل الكلوي8. تتوفر شرائط كاشف متعددة وكواشف قياس الألوان تجاريا لمراقبة المشكلة. ومع ذلك ، فإن فحص برادفورد رخيص ودقيق للغاية في تحديد بداية البيلة البروتينية ومسار التهاب الكلية الذئبي. هذا الفحص سريع ، ولا يتأثر الكاشف بوجود المذيبات والمخازن المؤقتة وعوامل الاختزال وعوامل تخلب المعادن التي قد تكون في عينتك9،10،11.

أحد الجوانب المهمة التي يجب مراعاتها هو تسلل الخلايا في الكلى. هذه التسلل تعزز التسبب في المرض عن طريق تحفيز إفراز العوامل القابلة للذوبان مثل السيتوكينات لتفاقم الالتهاب12. لفهم أفضل لمجموعات الخلايا الموجودة في التسلل ، فإن الطريقة المفيدة هي عزل الكريات البيض13. هنا ، يتم استخدام الكشف عن التسلل الكلوي للخلايا البائية كمثال. يبدأ الإجراء بعملية هضم مع ديوكسي ريبونوكلياز (DNase) والكولاجيناز ، يليه فصل تدرج الكثافة الذي يزيل الحطام وخلايا الدم الحمراء والخلايا المحببة الكثيفة. سبب عزل الخلايا البائية (CD19+) وخلايا البلازما (CD138+) هو أن الكلى الذئبية يمكن أن تركز هذه الخلايا14. يقترح أن وجود الخلايا البائية في مجاميع صغيرة في الكلى يمكن أن يشير إلى التوسع النسيلي ، وبالتالي إنتاج الغلوبولين المناعي (Ig). من المعروف أن خلايا البلازما موجودة في هذه المجاميع بالإضافة إلى15. بمجرد عزل الكريات البيض ، يمكن استخدام فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) لتحليل الخلايا ذات الأهمية عند تلطيخ الأجسام المضادة المختلفة المترافقة مع التألق.

التألق المناعي هو أحد طرق الكشف عن الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) التي تسمح بالتصور الفلوري للبروتينات في عينات أنسجة الكلى السميكة 4 ميكرومتر. تعتمد طرق الكشف الأخرى عن المدينة العالمية للخدمات الإنسانية على طبيعة التحليلات وكيمياء الربط وعوامل أخرى16. التألق المناعي هو طريقة تحديد سريعة تعرض المستضد لنظيره من الأجسام المضادة الموسومة بفلوروكروم معين (أو صبغة فلورسنت). عندما يكون متحمسا ، فإنه ينتج ضوءا يمكن أن يكتشفه المجهر الفلوري. يمكن استخدام هذه التقنية لمراقبة ترسب المكمل C3 و IgG2a17. يمكن أن يرتبط التنشيط المفرط للتسلسل التكميلي باستجابة مناعية غير منضبطة وفقدان الوظيفة18. يعد الترسب المناعي للأجسام المضادة للحمض النووي المزدوج (anti-dsDNA) في الكلى مصدر قلق كبير19 ، حيث ارتبط أولئك الذين لديهم النمط المتماثل IgG2a ب LN20. على وجه التحديد ، تظهر الأجسام المضادة المضادة ل dsDNA المزيد من الإمراض والتقارب مع المواد النووية ، وتشكل مجمعات مناعية21. عندما يكون IgG2a موجودا ، يتم تنشيط سلسلة المكمل ، بما في ذلك C3 ، لإزالة المجمعات المناعية22. يمكن تحديد علامات C3 و IgG2a كميا بشكل فردي أو تراكبها لإنشاء ارتباطها.

والجدير بالذكر أن قياس الكرياتينين في الدم هو تقنية أخرى موثوقة يمكن استخدامها مع بيلة دموية مجهرية وخزعات الكلى لتشخيص LN23. ومع ذلك ، فإن وجود البيلة البروتينية هو مؤشر قوي على تلف الكبيبات. وبهذا المعنى ، فإن مراقبة مستوى البيلة البروتينية أثناء مرض الذئبة يمكن أن تكشف عن بداية المرض وتكمل الطرق الأخرى لتشخيص مرض الذئبة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمجمعات المناعية المودعة في الكبيبات أن تحفز استجابة التهابية ، وتنشط نظام التكملة ، وتجند المزيد من الخلايا الالتهابية. نقطة أخرى جديرة بالملاحظة في هذا البروتوكول هي تسلل الخلايا البائية في الكلى. هذا ، جنبا إلى جنب مع الخلايا التائية المخترقة ، يضخم الاستجابات المناعية المحلية التي تؤدي إلى تلف الأعضاء. الأهم من ذلك ، أن تصنيف LN لا يعتمد فقط على التغيرات المورفولوجية الكبيبية التي شوهدت في الفحص المجهري ولكن أيضا على الرواسب المناعية التي لوحظت مع التألق المناعي. لذلك ، في هذا البروتوكول ، يتم تقديم طرق دقيقة وفعالة من حيث التكلفة لتحليل وظائف الكلى في إعدادات المختبر.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في Virginia Tech. نظرا لأن مرض الذئبة لديه معدل حدوث أعلى في الإناث ، فقد تم استخدام الفئران MRL / lpr الإناث فقط. بدأ جمع العينات في عمر 4 أسابيع وانتهى في 15 أسبوعا. تم الحصول على الفئران من مصادر تجارية (انظر جد…

Representative Results

يستخدم البروتوكول طرقا متعددة لتقييم الفئران MRL / lpr لالتهاب الكلية الذئبة. أولا ، يتم وصف إجراء لدراسة زيادة مستويات البيلة البروتينية بسبب اختلال وظائف الكلى بمرور الوقت. وكما هو مبين في الشكل 1، عولجت إناث الفئران بجرعة فموية تبلغ 200 ميكرولتر من المياه المالحة العازلة با?…

Discussion

LN هو السبب الرئيسي للوفيات في مرضى الذئبة الحمراء ، ولا تزال العوامل التي تؤدي إلى تفاقم المرض غير واضحة. تطبيق هذا البروتوكول هو توصيف وظائف الكلى باستخدام طرق متعددة ، بما في ذلك قياس البيلة البروتينية ، وتحليل FACS لكريات الدم البيضاء المعزولة في الكلى ، وتلطيخ التألق المناعي لأقسام الكل…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي ، ومختبر علم الأنسجة المرضي ، ومركز فرالين للتصوير في معهد فرجينيا للفنون التطبيقية ، وجامعة الولاية على الدعم الفني. يتم دعم هذا العمل من خلال العديد من المعاهد الوطنية للصحة والمنح الداخلية.

Materials

10x Tris-Buffered Saline (TBS) Thermo Fisher Scientific J60764.K2
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023
Anti-Human/Mouse C3 Cedarlane CL7632F
Anti-Mouse CD138 BV711 Biolegend 142519
Anti-Mouse CD45 AF700 Biolegend 103127
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-100G
Collagenase D Sigma-Aldrich 11088882001
Confocal Microscope LSM 880 Zeiss LSM 880
Coplin jar Fisher Scientific 50-212-281
Cryomold Fisher Scientific NC9511236
Density gradient medium GE Healthcare 17-1440-02 Percoll
DEPC-Treated water Thermo Fisher Scientific AM9906
DNase I Sigma-Aldrich D4527
dsDNA-EC InvivoGen tlrl-ecdna
Ethylenediaminetetraacetic Acid Fisher Scientific S311-500 EDTA
EVOS M5000 Microscope imaging system Thermo Fisher Scientific AMF5000
FACS Fusion Cell sorter BD Biosciences FACS Fusion
Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated R&D systems S11150H
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates Fisher Scientific 12-565-501
Graphpad prism GraphPad N/A
Hank’s Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific 14175-079
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630-080
ImageJ software National Institutes of Health N/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al. ATCC 23272
MEM non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) Jackson Lab 485
Nail enamel N/A N/A Any conventional store
O.C.T compound Tisse-Tek 4583
PAP pen Sigma-Aldrich Z377821
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Polysciences R-30
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 70011069
Pierce 20x TBS Buffer Thermo Fisher Scientific 28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit Thermo Fisher Scientific 23236 Albumin standard included
ProLon Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553141 FcR block
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-070
SpectraMax M5 Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.1 software
Sterile cell Strainers 100 µM Fisher Scientific 22363549
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Vancomycin Hydrochloride Goldbio V-200-1
Zombie Aqua Biolegend 423102 fluorescent dye for flow cytometry analysis

Riferimenti

  1. Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
  2. Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
  3. Maldonado, M. A., et al. The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice. Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).
  4. Lech, M., Anders, H. J. The pathogenesis of lupus nephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).
  5. Bagavant, H., Fu, S. M. Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus. Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).
  6. Li, Q. Z., et al. Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).
  7. Aragón, C. C., et al. Urinary biomarkers in lupus nephritis. Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).
  8. Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
  9. Lu, T. -. S., Yiao, S. -. Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -. L. Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification. North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).
  10. Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. How should proteinuria be detected and measured. Annals of Clinical Biochemistry. 46, 205-217 (2009).
  11. Viswanathan, G., Upadhyay, A. Assessment of proteinuria. Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).
  12. Hsieh, C., et al. Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring. Arthritis Care & Research. 63 (6), 865-874 (2011).
  13. Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bariéty, J. Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis. Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).
  14. Chang, A., et al. In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis. Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).
  15. Schrezenmeier, E., Jayne, D., Dörner, T. Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives. Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).
  16. Fitzgibbons, P. L., et al. Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).
  17. Lewis, M. J., Botto, M. Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity. Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).
  18. Watanabe, H., et al. Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B. Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).
  19. Yin, Z., et al. IL-10 regulates murine lupus. Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).
  20. Singh, R. R., et al. Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis. Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).
  21. van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).
  22. Zuniga, R., et al. Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles. Arthritis & Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).
  23. Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
  24. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
  25. Cabana-Puig, X., et al. Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota. Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).
  26. Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
  27. Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes. Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).
  28. Park, J. G. -., et al. Immune cell composition in normal human kidneys. Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).
  29. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  30. Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, &. #. 2. 1. 4. ;., Zıhnıoglu, F. Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).
check_url/it/63506?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Cabana-Puig, X., Luo, X. M. Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice. J. Vis. Exp. (184), e63506, doi:10.3791/63506 (2022).

View Video