Analysen der Proteinurie, der renalen Infiltration von Leukozyten und der renalen Ablagerung von Proteinen bei zu Lupus neigenden MRL/lpr-Mäusen
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Verfolgung des Lupusverlaufs bei Mäusen. Zwei zusätzliche Verfahren werden vorgestellt, um die Lupusnephritis basierend auf Zellinfiltration und Proteinablagerung in den Nieren zu charakterisieren.
Abstract
Systemischer Lupus erythematodes (SLE) ist eine Autoimmunerkrankung ohne bekannte Heilung und ist durch anhaltende Entzündungen in vielen Organen, einschließlich der Nieren, gekennzeichnet. Unter solchen Umständen verliert die Niere ihre Fähigkeit, Abfälle aus dem Blut zu entfernen und die Salz- und Flüssigkeitskonzentrationen zu regulieren, was schließlich zu Nierenversagen führt. Frauen, insbesondere solche im gebärfähigen Alter, werden neunmal häufiger diagnostiziert als Männer. Nierenerkrankungen sind die häufigste Todesursache bei SLE-Patienten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine schnelle und einfache Methode zur Messung der ausgeschiedenen Proteinspiegel im gesammelten Urin und verfolgt das Fortschreiten des Lupus im Laufe der Zeit. Darüber hinaus wird ein Ansatz zur Isolierung mononukleärer Nierenzellen basierend auf der Auswahl von Größe und Dichte bereitgestellt, um die renale Infiltration von Leukozyten zu untersuchen. Darüber hinaus wurde eine immunhistochemische Methode entwickelt, um die Proteinablagerung in den Glomeruli und die Leukozyteninfiltration im tubulointerstitiellen Raum zu charakterisieren. Zusammen können diese Methoden helfen, das Fortschreiten chronischer Entzündungen im Zusammenhang mit den Nieren von Lupus-anfälligen MRL / lpr-Mäusen zu untersuchen.
Introduction
Die Hauptfunktion der Niere ist die Ausscheidung toxischer Substanzen durch den Urin unter Aufrechterhaltung der Homöostase von Wasser und Salzen1. Diese Funktion ist bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) bedroht, was zu einer sogenannten Lupusnephritis (LN) führt. LN ist eine Folge des Immunsystems, das die Niere angreift, was zu anhaltenden Nierenentzündungen führt und daher seine Fähigkeit verliert, Abfälle aus dem Blut zu entfernen und Salz- und Flüssigkeitskonzentrationen zu regulieren. Dies führt schließlich zu Nierenversagen, das tödlich sein kann. Während des nephritischen Prozesses werden zirkulierende B-Zellen, T-Zellen und Monozyten in die Niere rekrutiert und sezernieren Chemokine, Zytokine und immunkomplexbildende Autoantikörper. Dies führt letztendlich zu Endothelzellschäden, membranösen Verletzungen, renaler tubulärer Atrophie und Fibrose2.
MRL/Mp-Fas lpr (MRL/lpr) Lupus-anfällige Mäuse sind ein klassisches Mausmodell, das lupusähnliche klinische Symptome aufweist, die dem menschlichen SLE3 ähneln. Dieses Modell hat maßgeblich zum Verständnis einer der häufigsten Todesursachen bei SLE-Patienten, der Lupusnephritis (LN)4, beigetragen. Sowohl beim menschlichen als auch bei der Maus-SLE ist LN durch eine allmähliche Entzündung gekennzeichnet, die durch renale Ablagerung von Immunkomplexen ausgelöst wird, gefolgt von Komplementaktivierung, Rekrutierung von Entzündungszellen und Verlust der Nierenfunktion5. Die Immunkomplexablagerung ist der erste Schritt, um die Chemokin- und Zytokinproduktion durch intrinsische Nierenzellen zu induzieren, die die Entzündungsreaktion durch Rekrutierung von Immunzellen erweitert6. Das aktuelle Protokoll präsentiert mehrere Techniken, um das Fortschreiten der Nierenerkrankung zu verfolgen, die die Zellinfiltration und die Ablagerung von Immunkomplexen analysieren.
Der wöchentlich gesammelte Urin ermöglicht die Erkennung und Visualisierung des zeitlichen Verlaufs der Proteinurie vor, während und nach dem Beginn des Lupus. Proteinurie als Biomarker kann das biologische Fortschreiten von LN bestimmen. Weitere Vorteile dieser Technik sind, dass sie nicht-invasiv, kostengünstig und einfach zu implementieren ist7. Wenn die Niere perfekt funktioniert, ist der Proteinurie-Spiegel konstant niedrig; Bei MRL/LPR-Mäusen wird jedoch nach einem Alter von 8-9 Wochen ein allmählicher Anstieg des Proteinuriespiegels beobachtet, der schließlich hoch genug ist, um Nierenversagen zu verursachen8. Mehrere Reagenzienstreifen und kolorimetrische Reagenzien sind im Handel erhältlich, um das Problem zu überwachen. Der Bradford-Test ist jedoch billig und sehr genau bei der Bestimmung des Beginns der Proteinurie und des Verlaufs der Lupusnephritis. Dieser Assay ist schnell und das Reagenz wird nicht durch das Vorhandensein von Lösungsmitteln, Puffern, Reduktionsmitteln und Metallchelatbildnern beeinflusst, die sich in Ihrer Probe 9,10,11 befinden können.
Ein wichtiger zu berücksichtigender Aspekt ist die Zellinfiltration in der Niere. Diese Infiltrate fördern die Pathogenese, indem sie die Sekretion löslicher Faktoren wie Zytokine auslösen, um die Entzündung zu verschlimmern12. Um besser zu verstehen, welche Zellpopulationen in den Infiltraten vorhanden sind, ist eine nützliche Methode, Leukozyten zu isolieren13. Hier wird der Nachweis einer renalen Infiltration von B-Zellen als Beispiel verwendet. Das Verfahren beginnt mit einem Verdauungsprozess mit Desoxyribonuklease (DNase) und Kollagenase, gefolgt von einer Dichtegradiententrennung, die Trümmer, rote Blutkörperchen und dichte Granulozyten entfernt. Der Grund für die Isolierung von B-Zellen (CD19+) und Plasmazellen (CD138+) ist, dass Lupusnieren diese Zellen konzentrieren können14. Es wird vermutet, dass das Vorhandensein von B-Zellen in kleinen Aggregaten in der Niere auf eine klonale Expansion und folglich auf die Produktion von Immunglobulin (Ig) hinweisen kann. Es ist bekannt, dass Plasmazellen auch in diesen Aggregaten vorhanden sind15. Sobald Leukozyten isoliert wurden, kann die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) verwendet werden, um die interessierenden Zellen nach Färbung mit verschiedenen fluoreszenzkonjugierten Antikörpern zu analysieren.
Die Immunfluoreszenz ist eine der immunhistochemischen (IHC) Nachweismethoden, die eine fluoreszierende Visualisierung von Proteinen in 4 μm dicken Nierengewebeproben ermöglicht. Andere IHC-Nachweismethoden hängen von der Art der Analyten, der Bindungschemie und anderen Faktoren ab16. Immunfluoreszenz ist eine schnelle Identifizierungsmethode, bei der das Antigen seinem Gegenstück Antikörper ausgesetzt wird, der mit einem spezifischen Fluorochrom (oder einem Fluoreszenzfarbstoff) markiert ist. Wenn es angeregt wird, erzeugt es Licht, das ein Fluoreszenzmikroskop erkennen kann. Diese Technik kann verwendet werden, um die Ablagerung von Komplement C3 und IgG2a17 zu beobachten. Eine übermäßige Aktivierung der Komplementkaskade könnte mit einer unkontrollierten Immunantwort und einem Funktionsverlust in Verbindung gebracht werden18. Die Immunablagerung von Anti-Doppelstrang-DNA-Autoantikörpern (Anti-dsDNA) in der Niere ist ein Hauptanliegen19, wo diejenigen mit IgG2a-Isotyp mit LN20 assoziiert wurden. Insbesondere zeigen Anti-dsDNA-Antikörper mehr Pathogenität und Affinität zu Kernmaterialien und bilden Immunkomplexe21. Wenn IgG2a vorhanden ist, wird die Komplementkaskade, einschließlich C3, aktiviert, um die Immunkomplexezu beseitigen 22. Die C3- und IgG2a-Marker können einzeln quantifiziert oder überlagert werden, um ihre Korrelation herzustellen.
Insbesondere die Serumkreatininmessung ist eine weitere zuverlässige Technik, die zusammen mit mikroskopischer Hämaturie und Nierenbiopsien zur Diagnose von LN23 verwendet werden kann. Das Vorhandensein von Proteinurie ist jedoch ein starker Indikator für glomeruläre Schäden. In diesem Sinne kann die Überwachung des Proteinurie-Spiegels während Lupus den Ausbruch der Krankheit erkennen und andere Methoden zur Diagnose von Lupus ergänzen. Darüber hinaus können Immunkomplexe, die in Glomeruli abgelagert werden, eine Entzündungsreaktion auslösen, das Komplementsystem aktivieren und mehr Entzündungszellen rekrutieren. Ein weiterer bemerkenswerter Punkt dieses Protokolls ist die B-Zell-Infiltration in der Niere. Zusammen mit den infiltrierten T-Zellen verstärkt dies lokale Immunantworten, die Organschäden auslösen. Wichtig ist, dass die Klassifizierung von LN nicht nur auf glomerulären morphologischen Veränderungen basiert, die in der Mikroskopie beobachtet werden, sondern auch auf Immunablagerungen, die mit Immunfluoreszenz beobachtet werden. Daher werden in diesem Protokoll genaue und kostengünstige Methoden zur Analyse der Nierenfunktion im Labor angeboten.
Protocol
Representative Results
Discussion
LN ist eine der häufigsten Todesursachen bei SLE-Patienten, und Faktoren, die die Krankheit verschlimmern, bleiben unklar. Die Anwendung dieses Protokolls besteht darin, die Nierenfunktion mit mehreren Methoden zu charakterisieren, einschließlich der Messung der Proteinurie, der FACS-Analyse isolierter Nierenleukozyten und der Immunfluoreszenzfärbung von gefrorenen Nierenabschnitten.
Ein wichtiger Punkt, der beim Sammeln von Urin zu beachten ist, ist, dass man mit der Tageszeit und dem Ort …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Flow Cytometry Core Facility, dem Histopathology Laboratory, dem Fralin Imaging Center am Virginia Polytechnic Institute und der State University für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wird durch verschiedene NIH- und interne Zuschüsse unterstützt.
Materials
| 10x Tris-Buffered Saline (TBS) | Thermo Fisher Scientific | J60764.K2 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Anti-Human/Mouse C3 | Cedarlane | CL7632F | |
| Anti-Mouse CD138 BV711 | Biolegend | 142519 | |
| Anti-Mouse CD45 AF700 | Biolegend | 103127 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich | 11088882001 | |
| Confocal Microscope LSM 880 | Zeiss | LSM 880 | |
| Coplin jar | Fisher Scientific | 50-212-281 | |
| Cryomold | Fisher Scientific | NC9511236 | |
| Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Percoll |
| DEPC-Treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9906 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| dsDNA-EC | InvivoGen | tlrl-ecdna | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid | Fisher Scientific | S311-500 | EDTA |
| EVOS M5000 Microscope imaging system | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | |
| FACS Fusion Cell sorter | BD Biosciences | FACS Fusion | |
| Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated | R&D systems | S11150H | |
| Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Graphpad prism | GraphPad | N/A | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | N/A | |
| Lactobacillus reuteri Kandler et al. | ATCC | 23272 | |
| MEM non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) | Jackson Lab | 485 | |
| Nail enamel | N/A | N/A | Any conventional store |
| O.C.T compound | Tisse-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Polysciences | R-30 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 70011069 | |
| Pierce 20x TBS Buffer | Thermo Fisher Scientific | 28358 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23236 | Albumin standard included |
| ProLon Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553141 | FcR block |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.1 software |
| Sterile cell Strainers 100 µM | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Vancomycin Hydrochloride | Goldbio | V-200-1 | |
| Zombie Aqua | Biolegend | 423102 | fluorescent dye for flow cytometry analysis |
Riferimenti
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