Il presente protocollo descrive un metodo per monitorare la progressione del lupus nei topi. Vengono presentate due procedure aggiuntive per caratterizzare la nefrite da lupus basate sull'infiltrazione cellulare e sulla deposizione di proteine nei reni.
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Articolo metodologico
Analisi della proteinuria, infiltrazione renale dei leucociti e deposizione renale di proteine in topi MRL/lpr inclini al lupus
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il lupus eritematoso sistemico (LES) è una malattia autoimmune senza cura nota ed è caratterizzata da infiammazione persistente in molti organi, compresi i reni. In tali circostanze, il rene perde la sua capacità di pulire i rifiuti dal sangue e regolare le concentrazioni di sale e liquidi, portando infine a insufficienza renale. Le donne, in particolare quelle in età fertile, vengono diagnosticate nove volte più spesso degli uomini. La malattia renale è la principale causa di mortalità nei pazienti affetti da LES. Il presente protocollo descrive un metodo rapido e semplice per misurare i livelli di proteine escrete nelle urine raccolte, monitorando la progressione del lupus nel tempo. Inoltre, viene fornito un approccio per isolare le cellule mononucleate renali basato sulla selezione delle dimensioni e della densità per studiare l'infiltrazione renale dei leucociti. Inoltre, è stato sviluppato un metodo immunoistochimico per caratterizzare la deposizione proteica nei glomeruli e l'infiltrazione dei leucociti nello spazio tubulointerstiziale. Insieme, questi metodi possono aiutare a studiare la progressione dell'infiammazione cronica associata ai reni dei topi MRL / LPR inclini al lupus.
Introduzione
La funzione primaria del rene è l'eliminazione delle sostanze tossiche attraverso l'urina mantenendo l'omeostasi di acqua e sali1. Questa funzione è minacciata nei pazienti con lupus eritematoso sistemico (LES), che porta alla cosiddetta nefrite da lupus (LN). La LN è una conseguenza del sistema immunitario che attacca il rene, portando a un'infiammazione renale persistente, perdendo quindi la sua capacità di pulire i rifiuti dal sangue e regolare le concentrazioni di sale e liquidi. Questo alla fine porterà a insufficienza renale, che può essere fatale. Durante il processo nefritico, le cellule B circolanti, le cellule T e i monociti vengono r....
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Protocollo
Il presente protocollo è approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Virginia Tech. Poiché la malattia da lupus ha una maggiore incidenza nelle femmine, sono stati utilizzati solo topi MRL / lpr femmina. La raccolta del campione è iniziata a 4 settimane di età e terminata a 15 settimane. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali) e sono stati allevati e mantenuti in uno specifico ambiente privo di agenti patogeni seguendo le linee guida istituzionali.
1. Test della proteinuria
- Raccogli l'urina seguendo i passaggi seguenti.
- S....
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Risultati
Il protocollo utilizza diversi metodi per valutare i topi MRL / lpr per la nefrite da lupus. In primo luogo, viene descritta una procedura per studiare l'aumento dei livelli di proteinuria a causa della disfunzione renale nel tempo. Come mostrato in Figura 1, topi femmina sono stati trattati con sonda gastrica orale di 200 μL di soluzione salina tamponata fosfato (1x PBS) come gruppo di controllo e probiotico Lactobacillus reuteri come gruppo di trattamento, ad una concentrazione di.......
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Discussione
La LN è una delle principali cause di mortalità nei pazienti affetti da LES e i fattori che aggravano la malattia rimangono poco chiari. L'applicazione di questo protocollo è quella di caratterizzare la funzione renale utilizzando molteplici metodi, tra cui la misurazione della proteinuria, l'analisi FACS di leucociti renali isolati e la colorazione con immunofluorescenza di sezioni renali congelate.
Un punto importante da considerare durante la raccolta dell'urina è che si deve essere coerent.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non vi è conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Ringraziamo la Flow Cytometry Core Facility, il Laboratorio di Istopatologia, il Fralin Imaging Center presso il Virginia Polytechnic Institute e la State University per il supporto tecnico. Questo lavoro è supportato da vari NIH e sovvenzioni interne.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10x soluzione salina tamponata Tris (TBS) | Thermo Fisher Scientific | J60764. K2 | |
| 2-mercaptoetanolo | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Anti-umano/topo C3 | Cedarlane | CL7632F | |
| Anti-topo CD138 BV711 | Biolegend | 142519 | |
| Anti-topo CD45 AF700 | Biolegend | 103127 | |
| Siero bovino Albumina | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
| Collagenasi D | Sigma-Aldrich | 11088882001 | |
| Microscopio confocale LSM 880 | Zeiss | LSM 880 | |
| Barattolo Coplin | Fisher Scientific | 50-212-281 | |
| Cryomold | Fisher Scientific | NC9511236 | |
| Gradiente di densità medio | GE Healthcare | 17-1440-02 | Percoll |
| DEPC-Acqua trattata | Thermo Fisher Scientific | AM9906 | |
| DNasi I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| dsDNA-EC | InvivoGen | tlrl-ecdna | |
| Acido etilendiamminotetraacetico | Fisher Scientific | S311-500 | EDTA |
| EVOS M5000 Sistema di imaging per microscopio | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | |
| FACS Fusion Selezionatore cellulare | BD Biosciences | bovino FACS Fusion | |
| - Premium, R& R inattivato a caldo | Sistemi D | S11150H | |
| Fisherbrand Piastre in polistirene a 96 pozzetti | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Prisma | GraphPad | N/A | |
| Hank' s Soluzione salina bilanciata | Thermo Fisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Software ImageJ | National Institutes of Health | N/A | |
| Lactobacillus reuteri Kandler et al. | ATCC | 23272 | |
| MEM aminoacidi non essenziali | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| MRL/MpJ-Fas lpr /J Topi (MRL/lpr) | Jackson Lab | 485 | |
| Smalto per unghie | N/A | N/A | Qualsiasi |
| composto OCT | Tisse-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Stampi per inclusione monouso Peel-A-Way | Polysciences | R-30 | |
| Penicillina-Streptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 70011069 | |
| Pierce 20x TBS Buffer | Thermo Fisher Scientific | 28358 | |
| Kit di test Pierce Coomassie Plus (Bradford) | Thermo Fisher Scientific | 23236 | Albumina standard inclusa |
| ProLon Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553141 | Blocco FcR |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Piruvato di sodio | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | N/A | Software SoftMax Pro 6.1 |
| Filtri per cellule sterili 100 &; micro; M | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Vancomicina cloridrato | Goldbio | V-200-1 | |
| Zombie Aqua | Biolegend | 423102 | colorante fluorescente per analisi di citometria a flusso |
Riferimenti
- Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
- Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
- Maldonado, M. A., et al.
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