वर्तमान प्रोटोकॉल चूहों में ल्यूपस प्रगति को ट्रैक करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। गुर्दे में कोशिका घुसपैठ और प्रोटीन जमाव के आधार पर ल्यूपस नेफ्राइटिस को चिह्नित करने के लिए दो अतिरिक्त प्रक्रियाएं प्रस्तुत की जाती हैं।
प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोसस (एसएलई) एक ऑटोइम्यून विकार है जिसका कोई ज्ञात इलाज नहीं है और गुर्दे सहित कई अंगों में लगातार सूजन की विशेषता है। ऐसी परिस्थितियों में, गुर्दा रक्त से अपशिष्ट को साफ करने और नमक और द्रव सांद्रता को विनियमित करने की अपनी क्षमता खो देता है, अंततः गुर्दे की विफलता का कारण बनता है। महिलाओं, विशेष रूप से प्रसव उम्र की महिलाओं को पुरुषों की तुलना में नौ गुना अधिक बार निदान किया जाता है। गुर्दे की बीमारी एसएलई रोगियों में मृत्यु दर का प्रमुख कारण है। वर्तमान प्रोटोकॉल एकत्र मूत्र में उत्सर्जित प्रोटीन के स्तर को मापने के लिए एक त्वरित और सरल विधि का वर्णन करता है, समय के साथ ल्यूपस प्रगति को ट्रैक करता है। इसके अलावा, ल्यूकोसाइट्स के गुर्दे की घुसपैठ की जांच के लिए आकार और घनत्व चयन के आधार पर गुर्दे की मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान किया जाता है। इसके अलावा, एक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विधि को ग्लोमेरुली में प्रोटीन जमाव और ट्यूबुलोइंटरस्टिशियल स्पेस में ल्यूकोसाइट घुसपैठ को चिह्नित करने के लिए विकसित किया गया है। साथ में, ये विधियां ल्यूपस-प्रवण एमआरएल / एलपीआर चूहों के गुर्दे से जुड़ी पुरानी सूजन की प्रगति की जांच करने में मदद कर सकती हैं।
गुर्दे का प्राथमिक कार्य पानी और लवण के होमोस्टैसिस को बनाए रखते हुए मूत्र के माध्यम से विषाक्त पदार्थों का उन्मूलन है1. प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोसस (एसएलई) वाले रोगियों में इस कार्य को खतरा है, जिससे तथाकथित ल्यूपस नेफ्रैटिस (एलएन) होता है। एलएन गुर्दे पर हमला करने वाली प्रतिरक्षा प्रणाली का एक परिणाम है, जिससे लगातार गुर्दे की सूजन होती है, इसलिए रक्त से अपशिष्ट को साफ करने और नमक और द्रव सांद्रता को विनियमित करने की अपनी क्षमता खो देता है। यह अंततः गुर्दे की विफलता का कारण बनेगा, जो घातक हो सकता है। नेफ्रिटिक प्रक्रिया के दौरान, परिसंचारी बी कोशिकाओं, टी कोशिकाओं और मोनोसाइट्स को गुर्दे में भर्ती किया जाता है, जो केमोकिन्स, साइटोकिन्स और प्रतिरक्षा जटिल बनाने वाले ऑटोएंटिबॉडी को स्रावित करता है। यह अंततः एंडोथेलियल सेल क्षति, झिल्लीदार चोटों, गुर्दे ट्यूबलर शोष और फाइब्रोसिस2 में परिणाम देता है।
एमआरएल /एमपी-फासएलपीआर (एमआरएल /एलपीआर) ल्यूपस-प्रवण चूहों एक शास्त्रीय माउस मॉडल है जो ल्यूपस जैसे नैदानिक संकेतों का प्रदर्शन करता है जो मानव एसएलई3 जैसा दिखता है। यह मॉडल एसएलई रोगियों, ल्यूपस नेफ्रैटिस (एलएन) 4 में मृत्यु दर के प्रमुख कारणों में से एक को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। मानव और माउस एसएलई दोनों में, एलएन को प्रतिरक्षा परिसरों के गुर्दे के जमाव से ट्रिगर होने वाली क्रमिक सूजन की विशेषता है, इसके बाद पूरक सक्रियण, भड़काऊ कोशिकाओं की भर्ती और गुर्दे के कार्य का नुकसान5. प्रतिरक्षा जटिल जमाव आंतरिक गुर्दे की कोशिकाओं द्वारा केमोकाइन और साइटोकिन उत्पादन को प्रेरित करने के लिए पहला कदम है, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती करके भड़काऊ प्रतिक्रिया का विस्तार करताहै 6. वर्तमान प्रोटोकॉल गुर्दे की बीमारी की प्रगति का पालन करने के लिए कई तकनीकों को प्रस्तुत करता है जो सेल घुसपैठ और प्रतिरक्षा जटिल बयान का विश्लेषण करते हैं।
हर हफ्ते एकत्र मूत्र ल्यूपस की शुरुआत से पहले, दौरान और बाद में प्रोटीन्यूरिया के समय पाठ्यक्रम का पता लगाने और दृश्य की अनुमति देता है। बायोमार्कर के रूप में प्रोटीनुरिया एलएन की जैविक प्रगति को निर्धारित कर सकता है। इस तकनीक के अन्य फायदे यह हैं कि यह गैर-आक्रामक, लागत कुशल और लागू करने में आसानहै 7. जब गुर्दे पूरी तरह से काम कर रहे होते हैं, तो प्रोटीन्यूरिया का स्तर लगातार कम होता है; एलपीआर चूहों में, 8-9 सप्ताह की उम्र के बाद, प्रोटीनूरिया स्तर की क्रमिक वृद्धि, जो अंततः गुर्दे की विफलता8 का कारण बनने के लिए पर्याप्त है, मनाया जाता है। इस मुद्दे की निगरानी के लिए कई अभिकर्मक स्ट्रिप्स और वर्णमितीय अभिकर्मक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। हालांकि, ब्रैडफोर्ड परख प्रोटीनूरिया की शुरुआत और ल्यूपस नेफ्राइटिस के पाठ्यक्रम को निर्धारित करने में सस्ता और बहुत सटीक है। यह परख त्वरित है, और अभिकर्मक सॉल्वैंट्स, बफर, कम करने वाले एजेंटों और धातु-चेलेटिंग एजेंटों की उपस्थिति से प्रभावित नहीं है जो आपके नमूने 9,10,11 में हो सकते हैं।
विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू गुर्दे में कोशिका घुसपैठ है। ये घुसपैठ सूजन को खराब करने के लिए साइटोकिन्स जैसे घुलनशील कारकों के स्राव को ट्रिगर करके रोगजनन को बढ़ावा देते हैं12. बेहतर ढंग से समझने के लिए कि घुसपैठ में कौन सी कोशिका आबादी मौजूद है, ल्यूकोसाइट्स13 को अलग करना एक उपयोगी तरीका है। यहां, बी कोशिकाओं के गुर्दे की घुसपैठ का पता लगाने का उपयोग एक उदाहरण के रूप में किया जाता है। प्रक्रिया डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिज (डीएनए) और कोलेजनेज के साथ पाचन प्रक्रिया के साथ शुरू होती है, इसके बाद घनत्व ढाल पृथक्करण होता है जो मलबे, लाल रक्त कोशिकाओं और घने ग्रैनुलोसाइट्स को हटा देता है। बी कोशिकाओं (सीडी 19 +) और प्लाज्मा कोशिकाओं (सीडी 138 +) को अलग करने का कारण यह है कि ल्यूपस गुर्दे इन कोशिकाओंको 14 पर केंद्रित कर सकते हैं। यह सुझाव दिया जाता है कि गुर्दे में छोटे समुच्चय में बी कोशिकाओं की उपस्थिति क्लोनल विस्तार का संकेत दे सकती है और परिणामस्वरूप, इम्युनोग्लोबुलिन (आईजी) उत्पादन। प्लाज्मा कोशिकाओं को इन समुच्चयों में भी मौजूद होने के लिए जाना जाता है15. एक बार ल्यूकोसाइट्स को अलग करने के बाद, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग विभिन्न प्रतिदीप्ति-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ धुंधला होने पर ब्याज की कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।
इम्यूनोफ्लोरेसेंस इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) का पता लगाने के तरीकों में से एक है जो 4 μm मोटी गुर्दे के ऊतकों के नमूनों में प्रोटीन के फ्लोरोसेंट विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। अन्य आईएचसी का पता लगाने के तरीके विश्लेषण, बाध्यकारी रसायन विज्ञान और अन्य कारकों की प्रकृति पर निर्भर करतेहैं 16. इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक तेजी से पहचान विधि है जो एंटीजन को एक विशिष्ट फ्लोरोक्रोम (या फ्लोरोसेंट डाई) के साथ लेबल किए गए अपने समकक्ष एंटीबॉडी को उजागर करती है। उत्तेजित होने पर, यह प्रकाश पैदा करता है जो एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का पता लगा सकता है। इस तकनीक का उपयोग पूरक सी 3 और आईजीजी 2 ए17 के जमाव का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। अत्यधिक पूरक कैस्केड सक्रियण एक अनियंत्रित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और हानि-ऑफ-फ़ंक्शन18 से जुड़ा हो सकता है। गुर्दे में एंटी-डबल-फंसे डीएनए (एंटी-डीएसडीएनए) ऑटोएंटिबॉडी का प्रतिरक्षा जमाव एक प्रमुख चिंता का विषय है, जहां आईजीजी 2 ए आइसोटाइप वाले लोग एलएन20 से जुड़े हुए हैं। विशेष रूप से, एंटी-डीएसडीएनए एंटीबॉडी परमाणु सामग्रियों के लिए अधिक रोगजनकता और आत्मीयता प्रदर्शित करते हैं, जिससे प्रतिरक्षा परिसर21 बनते हैं। जब आईजीजी 2 ए मौजूद होता है, तो सी 3 सहित पूरक कैस्केड, प्रतिरक्षा परिसरों22 को साफ करने के लिए सक्रिय होता है। सी 3 और आईजीजी 2 ए मार्करों को व्यक्तिगत रूप से मात्रा निर्धारित की जा सकती है या उनके सहसंबंध को स्थापित करने के लिए मढ़ा जा सकता है।
विशेष रूप से, सीरम क्रिएटिनिन माप एक और विश्वसनीय तकनीक है जिसका उपयोग एलएन23 का निदान करने के लिए सूक्ष्म हेमट्यूरिया और गुर्दे की बायोप्सी के साथ किया जा सकता है। हालांकि, प्रोटीनमेह की उपस्थिति ग्लोमेरुलर क्षति का एक मजबूत संकेतक है। उस अर्थ में, ल्यूपस के दौरान प्रोटीनुरिया के स्तर की निगरानी करने से बीमारी की शुरुआत का पता लगाया जा सकता है और ल्यूपस के निदान के लिए अन्य तरीकों का पूरक हो सकता है। इसके अलावा, ग्लोमेरुली में जमा प्रतिरक्षा परिसर एक भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रेरित कर सकते हैं, पूरक प्रणाली को सक्रिय कर सकते हैं, और अधिक भड़काऊ कोशिकाओं की भर्ती कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल का एक और उल्लेखनीय बिंदु गुर्दे में बी सेल घुसपैठ है। यह, घुसपैठ टी कोशिकाओं के साथ, स्थानीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ाता है जो अंग क्षति को ट्रिगर करते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, एलएन का वर्गीकरण न केवल माइक्रोस्कोपी में देखे गए ग्लोमेरुलर मॉर्फोलॉजिकल परिवर्तनों पर आधारित है, बल्कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ देखे गए प्रतिरक्षा जमा भी है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, गुर्दे समारोह के विश्लेषण के लिए सटीक और लागत प्रभावी तरीके प्रयोगशाला सेटिंग्स में पेश किए जाते हैं।
एलएन एसएलई रोगियों में मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है, और बीमारी को बढ़ाने वाले कारक स्पष्ट नहीं हैं। इस प्रोटोकॉल का अनुप्रयोग प्रोटीन्यूरिया के माप, पृथक गुर्दे ल्यूकोसाइट्स के एफएसीएस विश्लेषण, और …
The authors have nothing to disclose.
हम तकनीकी सहायता के लिए फ्लो साइटोमेट्री कोर सुविधा, हिस्टोपैथोलॉजी प्रयोगशाला, वर्जीनिया पॉलिटेक्निक इंस्टीट्यूट में फ्रालिन इमेजिंग सेंटर और स्टेट यूनिवर्सिटी को धन्यवाद देते हैं। यह काम विभिन्न एनआईएच और आंतरिक अनुदानों द्वारा समर्थित है।
10x Tris-Buffered Saline (TBS) | Thermo Fisher Scientific | J60764.K2 | |
2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
Anti-Human/Mouse C3 | Cedarlane | CL7632F | |
Anti-Mouse CD138 BV711 | Biolegend | 142519 | |
Anti-Mouse CD45 AF700 | Biolegend | 103127 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
Collagenase D | Sigma-Aldrich | 11088882001 | |
Confocal Microscope LSM 880 | Zeiss | LSM 880 | |
Coplin jar | Fisher Scientific | 50-212-281 | |
Cryomold | Fisher Scientific | NC9511236 | |
Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Percoll |
DEPC-Treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9906 | |
DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
dsDNA-EC | InvivoGen | tlrl-ecdna | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid | Fisher Scientific | S311-500 | EDTA |
EVOS M5000 Microscope imaging system | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | |
FACS Fusion Cell sorter | BD Biosciences | FACS Fusion | |
Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated | R&D systems | S11150H | |
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
Graphpad prism | GraphPad | N/A | |
Hank’s Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-079 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
ImageJ software | National Institutes of Health | N/A | |
Lactobacillus reuteri Kandler et al. | ATCC | 23272 | |
MEM non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) | Jackson Lab | 485 | |
Nail enamel | N/A | N/A | Any conventional store |
O.C.T compound | Tisse-Tek | 4583 | |
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Polysciences | R-30 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 70011069 | |
Pierce 20x TBS Buffer | Thermo Fisher Scientific | 28358 | |
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23236 | Albumin standard included |
ProLon Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553141 | FcR block |
RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
SpectraMax M5 | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.1 software |
Sterile cell Strainers 100 µM | Fisher Scientific | 22363549 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Vancomycin Hydrochloride | Goldbio | V-200-1 | |
Zombie Aqua | Biolegend | 423102 | fluorescent dye for flow cytometry analysis |