Analisi della proteinuria, infiltrazione renale dei leucociti e deposizione renale di proteine in topi MRL/lpr inclini al lupus

Summary

Il presente protocollo descrive un metodo per monitorare la progressione del lupus nei topi. Vengono presentate due procedure aggiuntive per caratterizzare la nefrite da lupus basate sull’infiltrazione cellulare e sulla deposizione di proteine nei reni.

Abstract

Il lupus eritematoso sistemico (LES) è una malattia autoimmune senza cura nota ed è caratterizzata da infiammazione persistente in molti organi, compresi i reni. In tali circostanze, il rene perde la sua capacità di pulire i rifiuti dal sangue e regolare le concentrazioni di sale e liquidi, portando infine a insufficienza renale. Le donne, in particolare quelle in età fertile, vengono diagnosticate nove volte più spesso degli uomini. La malattia renale è la principale causa di mortalità nei pazienti affetti da LES. Il presente protocollo descrive un metodo rapido e semplice per misurare i livelli di proteine escrete nelle urine raccolte, monitorando la progressione del lupus nel tempo. Inoltre, viene fornito un approccio per isolare le cellule mononucleate renali basato sulla selezione delle dimensioni e della densità per studiare l’infiltrazione renale dei leucociti. Inoltre, è stato sviluppato un metodo immunoistochimico per caratterizzare la deposizione proteica nei glomeruli e l’infiltrazione dei leucociti nello spazio tubulointerstiziale. Insieme, questi metodi possono aiutare a studiare la progressione dell’infiammazione cronica associata ai reni dei topi MRL / LPR inclini al lupus.

Introduction

La funzione primaria del rene è l’eliminazione delle sostanze tossiche attraverso l’urina mantenendo l’omeostasi di acqua e sali¹. Questa funzione è minacciata nei pazienti con lupus eritematoso sistemico (LES), che porta alla cosiddetta nefrite da lupus (LN). La LN è una conseguenza del sistema immunitario che attacca il rene, portando a un’infiammazione renale persistente, perdendo quindi la sua capacità di pulire i rifiuti dal sangue e regolare le concentrazioni di sale e liquidi. Questo alla fine porterà a insufficienza renale, che può essere fatale. Durante il processo nefritico, le cellule B circolanti, le cellule T e i monociti vengono reclutati nel rene, secernendo chemochine, citochine e autoanticorpi che formano complessi immunitari. Ciò alla fine si traduce in danno alle cellule endoteliali, lesioni membranose, atrofia tubulare renale e fibrosi².

MRL / Mp-Fas lpr (MRL / ^lpr) topi inclini al lupus sono un modello murino classico che presenta segni clinici simili al lupus che assomigliano al LES umano³. Questo modello è stato determinante per comprendere una delle principali cause di mortalità nei pazienti affetti da LES, la nefrite da lupus (LN)⁴. Sia nel LES umano che in quello murino, la LN è caratterizzata da un’infiammazione graduale innescata dalla deposizione renale di immunocomplessi, seguita dall’attivazione del complemento, dal reclutamento di cellule infiammatorie e dalla perdita della funzionalità renale⁵. La deposizione di immunocomplessi è il primo passo per indurre la produzione di chemochine e citochine da parte delle cellule renali intrinseche, che espande la risposta infiammatoria reclutando cellule immunitarie⁶. L’attuale protocollo presenta diverse tecniche per seguire la progressione della malattia renale che analizzano l’infiltrazione cellulare e la deposizione di complessi immunitari.

L’urina raccolta ogni settimana consente il rilevamento e la visualizzazione del decorso temporale della proteinuria prima, durante e dopo l’insorgenza del lupus. La proteinuria come biomarcatore può determinare la progressione biologica dei LN. Altri vantaggi di questa tecnica sono che non è invasiva, economica e facile da implementare⁷. Quando il rene funziona perfettamente, il livello di proteinuria è costantemente basso; tuttavia, nei topi MRL/LPR, dopo 8-9 settimane di età, si osserva un graduale aumento del livello di proteinuria, che alla fine è abbastanza alto da causare insufficienza renale⁸. Strisce di reagenti multipli e reagenti colorimetrici sono disponibili in commercio per monitorare il problema. Tuttavia, il test di Bradford è economico e molto accurato nel determinare l’insorgenza della proteinuria e il decorso della nefrite da lupus. Questo test è rapido e il reagente non è influenzato dalla presenza di solventi, tamponi, agenti riducenti e agenti chelanti dei metalli che possono essere nel campione 9,10,11.

Un aspetto importante da considerare è l’infiltrazione cellulare nel rene. Questi infiltrati promuovono la patogenesi innescando la secrezione di fattori solubili come le citochine per peggiorare l’infiammazione¹². Per capire meglio quali popolazioni cellulari sono presenti negli infiltrati, un metodo utile è quello di isolare i leucociti¹³. Qui, il rilevamento dell’infiltrazione renale delle cellule B viene utilizzato come esempio. La procedura inizia con un processo di digestione con desossiribonucleasi (DNasi) e collagenasi, seguito dalla separazione del gradiente di densità che rimuove detriti, globuli rossi e granulociti densi. La ragione per isolare le cellule B (CD19+) e le plasmacellule (CD138⁺) è che i reni lupus possono concentrare queste cellule¹⁴. Si suggerisce che la presenza di cellule B in piccoli aggregati nel rene possa indicare l’espansione clonale e, di conseguenza, la produzione di immunoglobuline (Ig). Le plasmacellule sono ben note per essere presenti anche in questi aggregati¹⁵. Una volta isolati i leucociti, la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) può essere utilizzata per analizzare le cellule di interesse dopo la colorazione con diversi anticorpi coniugati a fluorescenza.

L’immunofluorescenza è uno dei metodi di rilevamento dell’immunoistochimica (IHC) che consente la visualizzazione fluorescente delle proteine in campioni di tessuto renale spessi 4 μm. Altri metodi di rilevazione IHC dipendono dalla natura degli analiti, dalla chimica di legame e da altri fattori¹⁶. L’immunofluorescenza è un metodo di identificazione rapida che espone l’antigene alla sua controparte anticorpo marcato con uno specifico fluorocromo (o un colorante fluorescente). Quando è eccitato, produce luce che un microscopio a fluorescenza può rilevare. Questa tecnica può essere utilizzata per osservare la deposizione di complemento C3 e IgG2a¹⁷. Un’eccessiva attivazione a cascata del complemento potrebbe essere associata a una risposta immunitaria incontrollata e alla perdita di funzione¹⁸. La deposizione immunitaria di autoanticorpi anti-DNA a doppio filamento (anti-dsDNA) nel rene è una delle principali preoccupazioni¹⁹, dove quelli con isotipo IgG2a sono stati associati a LN²⁰. In particolare, gli anticorpi anti-dsDNA mostrano maggiore patogenicità e affinità con i materiali nucleari, formando immunocomplessi²¹. Quando IgG2a è presente, la cascata del complemento, incluso C3, viene attivata per eliminare gli immunocomplessi²². I marcatori C3 e IgG2a possono essere quantificati singolarmente o sovrapposti per stabilire la loro correlazione.

In particolare, la misurazione della creatinina sierica è un’altra tecnica affidabile che può essere utilizzata insieme all’ematuria microscopica e alle biopsie renali per diagnosticare LN²³. Tuttavia, la presenza di proteinuria è un forte indicatore di danno glomerulare. In questo senso, il monitoraggio del livello di proteinuria durante il lupus può rilevare l’insorgenza della malattia e integrare altri metodi per diagnosticare il lupus. Inoltre, gli immunocomplessi depositati nei glomeruli possono indurre una risposta infiammatoria, attivare il sistema del complemento e reclutare più cellule infiammatorie. Un altro punto degno di nota di questo protocollo è l’infiltrazione delle cellule B nel rene. Questo, insieme alle cellule T infiltrate, amplifica le risposte immunitarie locali che innescano danni agli organi. È importante sottolineare che la classificazione dei LN non si basa solo sui cambiamenti morfologici glomerulari osservati al microscopio, ma anche sui depositi immunitari osservati con l’immunofluorescenza. Pertanto, in questo protocollo, vengono offerti metodi accurati ed economici per l’analisi della funzionalità renale in ambienti di laboratorio.

Protocol

Il presente protocollo è approvato dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Virginia Tech. Poiché la malattia da lupus ha una maggiore incidenza nelle femmine, sono stati utilizzati solo topi MRL / lpr femmina. La raccolta del campione è iniziata a 4 settimane di età e terminata a 15 settimane. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali) e sono stati allevati e mantenuti in uno specifico ambiente privo di agenti patogeni seguendo le linee gui…

Representative Results

Il protocollo utilizza diversi metodi per valutare i topi MRL / lpr per la nefrite da lupus. In primo luogo, viene descritta una procedura per studiare l’aumento dei livelli di proteinuria a causa della disfunzione renale nel tempo. Come mostrato in Figura 1, topi femmina sono stati trattati con sonda gastrica orale di 200 μL di soluzione salina tamponata fosfato (1x PBS) come gruppo di controllo e probiotico Lactobacillus reuteri come gruppo di trattamento, ad una concentrazione d…

Discussion

La LN è una delle principali cause di mortalità nei pazienti affetti da LES e i fattori che aggravano la malattia rimangono poco chiari. L’applicazione di questo protocollo è quella di caratterizzare la funzione renale utilizzando molteplici metodi, tra cui la misurazione della proteinuria, l’analisi FACS di leucociti renali isolati e la colorazione con immunofluorescenza di sezioni renali congelate.

Un punto importante da considerare durante la raccolta dell’urina è che si deve essere coe…

Materials

10x Tris-Buffered Saline (TBS)	Thermo Fisher Scientific	J60764.K2
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985-023
Anti-Human/Mouse C3	Cedarlane	CL7632F
Anti-Mouse CD138 BV711	Biolegend	142519
Anti-Mouse CD45 AF700	Biolegend	103127
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418-100G
Collagenase D	Sigma-Aldrich	11088882001
Confocal Microscope LSM 880	Zeiss	LSM 880
Coplin jar	Fisher Scientific	50-212-281
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
Density gradient medium	GE Healthcare	17-1440-02	Percoll
DEPC-Treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9906
DNase I	Sigma-Aldrich	D4527
dsDNA-EC	InvivoGen	tlrl-ecdna
Ethylenediaminetetraacetic Acid	Fisher Scientific	S311-500	EDTA
EVOS M5000 Microscope imaging system	Thermo Fisher Scientific	AMF5000
FACS Fusion Cell sorter	BD Biosciences	FACS Fusion
Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated	R&D systems	S11150H
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates	Fisher Scientific	12-565-501
Graphpad prism	GraphPad	N/A
Hank’s Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14175-079
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al.	ATCC	23272
MEM non-essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)	Jackson Lab	485
Nail enamel	N/A	N/A	Any conventional store
O.C.T compound	Tisse-Tek	4583
PAP pen	Sigma-Aldrich	Z377821
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Polysciences	R-30
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	70011069
Pierce 20x TBS Buffer	Thermo Fisher Scientific	28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit	Thermo Fisher Scientific	23236	Albumin standard included
ProLon Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553141	FcR block
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
Sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-070
SpectraMax M5	Molecular Devices	N/A	SoftMax Pro 6.1 software
Sterile cell Strainers 100 µM	Fisher Scientific	22363549
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Vancomycin Hydrochloride	Goldbio	V-200-1
Zombie Aqua	Biolegend	423102	fluorescent dye for flow cytometry analysis