狼瘡を起こしやすいMRL/lprマウスにおけるタンパク質尿、白血球の腎浸潤、およびタンパク質の腎沈着の解析
Summary
本プロトコールは、マウスにおけるループス進行を追跡する方法を記載する。腎臓における細胞浸潤およびタンパク質沈着に基づいて狼瘡腎炎を特徴付けるために、2つの追加の手順が提示される。
Abstract
全身性エリテマトーデス(SLE)は、既知の治療法のない自己免疫疾患であり、腎臓を含む多くの器官における持続的な炎症を特徴とする。このような状況下では、腎臓は血液から老廃物をきれいにし、塩分および体液濃度を調節する能力を失い、最終的に腎不全につながる。女性、特に妊娠可能年齢の女性は、男性の9倍の頻度で診断されます。腎臓病はSLE患者の死亡率の主要な原因です。本プロトコールは、採取した尿中の排泄タンパク質レベルを測定し、時間の経過とともに狼瘡の進行を追跡する迅速かつ簡単な方法を記載している。さらに、白血球の腎浸潤を調査するために、サイズおよび密度選択に基づいて腎臓単核球を単離するアプローチが提供される。さらに、糸球体におけるタンパク質沈着および尿細管間質腔における白血球浸潤を特徴付けるために、免疫組織化学的方法が開発されている。これらの方法は、狼瘡を起こしやすいMRL/lprマウスの腎臓に関連する慢性炎症の進行を調査するのに役立つ可能性がある。
Introduction
腎臓の主な機能は、水と塩の恒常性を維持しながら、尿を通して有毒物質を排除することです1。この機能は、全身性エリテマトーデス(SLE)の患者において脅かされ、いわゆるループス腎炎(LN)につながる。LNは、免疫系が腎臓を攻撃し、持続的な腎臓の炎症を引き起こし、したがって血液から老廃物をきれいにし、塩分および体液濃度を調節する能力を失う結果である。これは最終的に腎不全につながります, これは致命的であり得る.腎炎プロセスの間、循環するB細胞、T細胞、および単球が腎臓にリクルートされ、ケモカイン、サイトカイン、および免疫複合体形成自己抗体を分泌する。これは最終的に、内皮細胞損傷、膜性傷害、腎尿細管萎縮、および線維症をもたらす2。
MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr)狼瘡を起こしやすいマウスは、ヒトSLE3に似た狼瘡様の臨床徴候を示す古典的なマウスモデルである。このモデルは、SLE患者における主要な死亡原因の1つであるループス腎炎(LN)4の理解に役立ってきました。ヒトおよびマウスSLEの両方において、LNは、免疫複合体の腎沈着によって引き起こされる漸進的な炎症、続いて補体活性化、炎症性細胞の動員、および腎機能の喪失を特徴とする5。免疫複合体沈着は、内因性腎細胞によるケモカインおよびサイトカイン産生を誘導する第1段階であり、これは免疫細胞を動員することによって炎症反応を拡大する6。現在のプロトコルは、細胞浸潤および免疫複合体沈着を分析する腎疾患の進行を追跡するためのいくつかの技術を提示する。
毎週採取された尿は、狼瘡発症前、発症中、および発症後のタンパク質尿症の経時変化の検出および可視化を可能にする。バイオマーカーとしてのタンパク尿はLNの生物学的進行を決定することができる。この技術の他の利点は、非侵襲的であり、費用対効果が高く、かつ実装が容易であることです7。腎臓が完全に機能しているとき、タンパク質尿症レベルは一貫して低いです。しかし、MRL/lprマウスでは、8〜9週齢以降、蛋白尿レベルの漸進的な上昇、すなわち最終的には腎不全を引き起こすのに十分な高さが観察される8。問題を監視するために、複数の試薬ストリップおよび比色試薬が市販されている。しかし、ブラッドフォードアッセイは安価で、タンパク質尿症の発症およびループス腎炎の経過を決定する上で非常に正確である。このアッセイは迅速であり、試薬は、サンプル9、10、11中に存在する可能性のある溶媒、緩衝液、還元剤、および金属キレート剤の存在の影響を受けません。
考慮すべき重要な側面の1つは、腎臓における細胞浸潤である。これらの浸潤物は、サイトカインなどの可溶性因子の分泌を誘発して炎症を悪化させることにより病因を促進する12。浸潤物中にどのような細胞集団が存在するかをよりよく理解するために、有用な方法は白血球を単離することである13。ここでは、B細胞の腎浸潤の検出を例に挙げて用いる。この手順は、デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)およびコラゲナーゼによる消化プロセスから始まり、続いて破片、赤血球、および高密度顆粒球を除去する密度勾配分離が続く。B細胞(CD19+)および形質細胞(CD138+)を単離する理由は、狼瘡腎臓がこれらの細胞14を濃縮することができるからである。腎臓の小さな凝集体中のB細胞の存在は、クローン拡張、ひいては免疫グロブリン(Ig)産生を示すことができることが示唆される。形質細胞は、これらの凝集体と同様に15中に存在することがよく知られている。白血球が単離されると、蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して、異なる蛍光結合抗体による染色時に目的の細胞を分析することができます。
免疫蛍光は、厚さ4 μmの腎臓組織サンプル中のタンパク質の蛍光可視化を可能にする免疫組織化学(IHC)検出方法の1つです。他のIHC検出方法は、分析物の性質、結合化学、および他の因子に依存する16。免疫蛍光は、抗原を特定の蛍光色素(または蛍光色素)で標識された対応抗体に曝露する迅速な同定方法である。励起すると、蛍光顕微鏡が検出できる光を生成します。この技術は、補体C3およびIgG2a17の沈着を観察するために使用することができる。過剰な補体カスケード活性化は、制御不能な免疫応答および機能喪失と関連している可能性がある18。腎臓における抗二本鎖DNA(抗dsDNA)自己抗体の免疫沈着は大きな懸念事項であり19、IgG2aアイソタイプを有するものはLN20と関連している。具体的には、抗dsDNA抗体は、核物質に対してより病原性および親和性を示し、免疫複合体21を形成する。IgG2aが存在すると、C3を含む補体カスケードが活性化され、免疫複合体22を消去する。C3マーカーとIgG2aマーカーを個別に定量化することも、重ね合わせて相関関係を確立することもできます。
特に、血清クレアチニン測定は、LN23を診断するために顕微鏡的血尿および腎臓生検と共に使用することができる別の信頼できる技術である。しかし、タンパク尿症の存在は糸球体損傷の強力な指標である。その意味で、狼瘡中のタンパク尿症レベルを監視することは、疾患の発症を検出し、狼瘡を診断するための他の方法を補完することができる。さらに、糸球体に沈着した免疫複合体は、炎症反応を誘導し、補体系を活性化し、より多くの炎症細胞をリクルートすることができる。このプロトコルのもう一つの注目すべき点は、腎臓におけるB細胞浸潤である。これは、浸潤したT細胞とともに、臓器損傷を引き起こす局所免疫応答を増幅する。重要なことに、LNの分類は、顕微鏡で見られる糸球体形態学的変化だけでなく、免疫蛍光で観察される免疫沈着にも基づいている。したがって、このプロトコルでは、腎機能の分析のための正確で費用対効果の高い方法が実験室の設定で提供される。
Protocol
Representative Results
Discussion
LNはSLE患者の死亡率の主要な原因であり、この疾患を悪化させる要因は依然として不明である。このプロトコルの適用は、タンパク尿症の測定、単離された腎臓白血球のFACS分析、および凍結腎臓切片の免疫蛍光染色を含む複数の方法を使用して腎機能を特徴付けることである。
尿を採取する際に考慮すべき重要な点の1つは、時刻と尿収集の場所と一致しなければならな?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
フローサイトメトリーコア施設、病理組織研究所、バージニア工科大学のフラリンイメージングセンター、州立大学の技術サポートに感謝します。この作業は、さまざまなNIHおよび内部助成金によってサポートされています。
Materials
| 10x Tris-Buffered Saline (TBS) | Thermo Fisher Scientific | J60764.K2 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Anti-Human/Mouse C3 | Cedarlane | CL7632F | |
| Anti-Mouse CD138 BV711 | Biolegend | 142519 | |
| Anti-Mouse CD45 AF700 | Biolegend | 103127 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
| Collagenase D | Sigma-Aldrich | 11088882001 | |
| Confocal Microscope LSM 880 | Zeiss | LSM 880 | |
| Coplin jar | Fisher Scientific | 50-212-281 | |
| Cryomold | Fisher Scientific | NC9511236 | |
| Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Percoll |
| DEPC-Treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9906 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| dsDNA-EC | InvivoGen | tlrl-ecdna | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid | Fisher Scientific | S311-500 | EDTA |
| EVOS M5000 Microscope imaging system | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | |
| FACS Fusion Cell sorter | BD Biosciences | FACS Fusion | |
| Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated | R&D systems | S11150H | |
| Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Graphpad prism | GraphPad | N/A | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | N/A | |
| Lactobacillus reuteri Kandler et al. | ATCC | 23272 | |
| MEM non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) | Jackson Lab | 485 | |
| Nail enamel | N/A | N/A | Any conventional store |
| O.C.T compound | Tisse-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Polysciences | R-30 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 70011069 | |
| Pierce 20x TBS Buffer | Thermo Fisher Scientific | 28358 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23236 | Albumin standard included |
| ProLon Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553141 | FcR block |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.1 software |
| Sterile cell Strainers 100 µM | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Vancomycin Hydrochloride | Goldbio | V-200-1 | |
| Zombie Aqua | Biolegend | 423102 | fluorescent dye for flow cytometry analysis |
Riferimenti
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